Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

BBB is een unieke biologische interface tussen bloedcirculatie en zenuwweefsel, die is samengesteld uit vasculaire endotheelcellen, pericyten, astrocyten, neuronen en andere cellulaire^structuren1. De stroom van ionen, chemicaliën en cellen tussen het bloed en de hersenen wordt strikt gereguleerd door deze barrière. Deze homeostase beschermt de zenuwweefsels tegen gifstoffen en ziekteverwekkers en maakt tegelijkertijd de juiste werking van de zenuwen van de hersenen mogelijk ^2,3. Het handhaven van de integriteit van de BBB kan de ontwikkeling en progressie van aandoeningen die het centrale zenuwstelsel aantasten, zoals neuronale disfunctie, oedeem en neuro-inflammatie, effectief voorkomen. De unieke fysiologische eigenschappen van de BBB voorkomen echter dat meer dan 98% van de medicijnen met kleine moleculen en 100% van de macromoleculaire geneesmiddelen het centrale zenuwstelsel^{binnendringen.} Daarom is het verhogen van de penetratie van medicijnen via de BBB tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel essentieel voor het bereiken van therapeutische werkzaamheid ^6,7. Hoewel computersimulatiescreening van substraten de kans dat kandidaat-geneesmiddelen de BBB overschrijden aanzienlijk heeft verhoogd, zijn betrouwbare en betaalbare in vitro/in vivo BBB-modellen nog steeds nodig om aan de behoeften van wetenschappelijk onderzoek te voldoen⁸.

Een snelle en betaalbare techniek voor high-throughput drug screening is het in vitro model⁹. Om licht te werpen op de fundamentele processen van de effecten van geneesmiddelen op de BBB-functie en hun rol in de ontwikkeling en progressie van ziekten, is een reeks vereenvoudigde in vitro BBB-modellen gemaakt. Op dit moment zijn de gebruikelijke in vitro BBB-modellen de monolaag-, co-cultuur-, dynamische en microfluïdische modellen 10,11,12, geconstrueerd door vasculaire endotheelcellen en astrocyten, pericyten of microglia ^13,14. Hoewel 3D-celculturen meer in overeenstemming zijn met de fysiologische structuur van BBB¹⁵, wordt hun toepassing als middel voor het screenen van geneesmiddelen op BBB nog steeds beperkt door hun ingewikkelde ontwerp en ondermaatse reproduceerbaarheid. Het monolayer in vitro model daarentegen wordt het meest gebruikt om de BBB te onderzoeken en is toepasbaar voor het bepalen van de expressie van membraantransporters en tight junction eiwitten in bepaalde cellen.

Transmembraan elektrische weerstandsmeting (TEER) is een techniek om de cellaag over de weerstand te evalueren en te bewaken en de celintegriteit en permeabiliteit van de barrière te evalueren. Door tegelijkertijd twee elektroden in het groeimedium of de bufferoplossing aan weerszijden van de monolaag te plaatsen, is het mogelijk om de wisselstroom of elektrische impedantie door de compacte laag van de cel te meten ^16,17. Om te bepalen of het in vitro BBB-model op de juiste manier is gemaakt, zal de meting van TEER meestal worden gebruikt als de gouden standaard¹⁸. Aan de andere kant kan de trend van medicatie-actie op BBB-permeabiliteit nauwkeurig worden voorspeld door de verandering in elektrische weerstand van de cellaag na betrokkenheid van het geneesmiddel te meten¹⁹. Feng et al. ontdekten bijvoorbeeld dat catalpol (het primaire actieve monomeer van rehmanniae) de door lipopolysaccharide geïnduceerde neerwaartse regulatie van tight junction-eiwitten in de BBB effectief kon omkeren en de TEER-waarde van de endotheelcellaag²⁰ van de muizenhersenen kon verhogen.

De neuro-inflammatoire reactie is meestal de belangrijkste oorzaak van een verstoring van de BBB-homeostase²¹. Hypoxische behandeling om neuro-inflammatoir letsel te induceren is de belangrijkste methode om de bloed-hersenbarrière te vernietigen, voornamelijk met inbegrip van fysische methoden en chemische reagensmethoden. De eerste maakt voornamelijk gebruik van een incubator met drie gassen om het zuurstofgehalte in de celgroeiomgeving te variëren om hypoxische omstandigheden te simuleren²², terwijl de laatste wordt bereikt door kunstmatig deoxyreagentia zoals CoCl₂ in het celkweekmedium^{te introduceren 23}. De cellen blijven zuurstofarm als Co²⁺ in het heem wordt vervangen door Fe²⁺. Als Fe²⁺ wordt gesubstitueerd door Co²⁺ in de katalytische groep, wordt de activiteit van prolinehydroxylase en aspartaathydroxylase geremd, wat resulteert in een accumulatie van hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α)²⁴. Bij aanhoudende hypoxie veroorzaakt de defosforylering van HIF-1α in het cytoplasma celdood en activeert de vasculaire endotheliale groeifactor, die uiteindelijk de vasculaire permeabiliteit verhoogt. In eerdere studies ^25,26 is goed aangetoond dat hypoxie de expressie van endotheliale tight junction-eiwitten aanzienlijk kan verminderen om de permeabiliteit van BBB te vergroten. In deze studie werd de tijdweerstandscurve van bEnd.3-cellen gezaaid in platen met 24 putjes gemeten om een eenvoudig BBB-model te creëren. Met behulp van dit model hebben we de veranderingen in cel-TEER na CoCl_{2-interventie} gekarakteriseerd om een celmodel te construeren dat kan worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen op BBB-bescherming.