経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

BBBは、血管内皮細胞、周皮細胞、星状膠細胞、ニューロン、その他の細胞構造で構成される血液循環と神経組織の間のユニークな生物学的インターフェースです¹。血液と脳の間のイオン、化学物質、細胞の流れは、このバリアによって厳密に制御されています。このホメオスタシスは、毒素や病原体から神経組織を保護すると同時に、脳の神経の適切な操作を可能にします^2,3。BBBの完全性を維持することで、神経機能障害、浮腫、神経炎症など、中枢神経系に影響を与える疾患の発症と進行を効果的に防ぐ^{ことができます4。}しかし、BBBのユニークな生理学的特性により、低分子医薬品の98%以上、高分子医薬品の100%が中枢神経系に入るのを防ぎます⁵。したがって、中枢神経系の薬剤の開発中にBBBを介した薬剤の浸透性を高めることは、治療効果を達成するために不可欠です^6,7。基質のコンピューターシミュレーションスクリーニングにより、医薬品候補がBBBを通過する確率が大幅に向上しましたが、科学研究のニーズを満たすためには、信頼性が高く手頃な価格のin vitro/in vivo BBBモデルが依然として必要です⁸。

ハイスループット薬物スクリーニングのための迅速で手頃な技術は、in vitroモデル⁹です。医薬品がBBB機能に及ぼす影響の基本的なプロセスと、疾患の発症と進行における医薬品の役割を明らかにするために、一連の簡略化されたin vitro BBBモデルが作成されました。現在、一般的なin vitro BBBモデルは、血管内皮細胞とアストロサイト、ペリサイト、またはミクログリアによって構築される単層、共培養、動的、およびマイクロ流体モデル10,11,12である^13,14。3D細胞培養はBBB¹⁵の生理学的構造とほぼ一致していますが、BBBの薬物スクリーニングの手段としての応用は、その複雑なデザインと標準以下の再現性によって依然として制約されています。対照的に、単分子膜in vitroモデルは、BBBの研究に最も頻繁に使用されるモデルであり、特定の細胞における膜トランスポーターおよびタイトジャンクションタンパク質の発現を決定するために適用できます。

膜貫通電気抵抗(TEER)測定は、抵抗を横切る細胞層を評価および監視し、バリアの細胞の完全性と透過性を評価する技術です。単分子膜の両側にある増殖培地または緩衝液に2つの電極を同時に挿入することにより、セルのコンパクト層^16,17を通る交流または電気インピーダンスを測定することができる。in vitro BBBモデルが適切に作成されているかどうかを判断するために、TEERの測定は通常、ゴールドスタンダード¹⁸として採用されます。一方、BBB透過性に対する薬物作用の傾向は、薬物関与後の細胞層の電気抵抗の変化を測定することによって正確に予測することができる¹⁹。例えば、Fengらは、カタルポール(レフマニアエの主要な活性モノマー)が、BBBのタイトジャンクションタンパク質のリポ多糖誘導性ダウンレギュレーションを効果的に逆転させ、マウス脳内皮細胞層のTEER値を上昇させることができることを発見しました²⁰。

神経炎症反応は、通常、BBBホメオスタシスの不均衡の主な原因である²¹。神経炎症性損傷を誘発する低酸素治療は、血液脳関門を破壊する主な方法であり、主に物理的方法と化学試薬法が含まれます。前者は、主に3ガスインキュベーターを利用して、細胞増殖環境中の酸素含有量を変化させて低酸素状態をシミュレートし²²、後者は、_CoCl2などのデオキシ試薬を細胞培養培地に人工的に導入することによって達成される²³。ヘム中のCo²⁺がFe²⁺に置換されている場合、細胞は脱酸素状態のままになります。触媒基でFe²⁺がCo²⁺に置換されると、プロリンヒドロキシラーゼとアスパラギン酸ヒドロキシラーゼ活性が阻害され、低酸素誘導因子-1α(HIF-1α)が蓄積する²⁴。持続的な低酸素状態では、細胞質におけるHIF-1αの脱リン酸化が細胞死を引き起こし、血管内皮増殖因子を活性化し、最終的に血管透過性を高めます。以前の研究^25,26では、低酸素症が内皮タイトジャンクションタンパク質の発現を大幅に低下させてBBBの透過性を高めることが十分に実証されています。本研究では、24ウェルプレートに播種したbEnd.3細胞の時間抵抗曲線を測定し、簡単なBBBモデルを作成しました。このモデルを用いて、CoCl₂介入後の細胞TEERの変化を特徴づけ、BBB保護のための薬物のスクリーニングに使用できる細胞モデルを構築しました。