bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

BBB, vasküler endotel hücreleri, perisitler, astrositler, nöronlar ve diğer hücresel yapılardan oluşan kan dolaşımı ve sinir dokusu arasında benzersiz bir biyolojik arayüzdür¹. Kan ve beyin arasındaki iyonların, kimyasalların ve hücrelerin akışı bu bariyer tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu homeostaz, sinir dokularını toksinlere ve patojenlere karşı korurken, aynı zamanda beyin sinirlerinin uygun şekilde çalışmasını sağlar ^2,3. BBB’nin bütünlüğünün korunması, nöronal disfonksiyon, ödem ve nöroinflamasyon gibi merkezi sinir sistemini etkileyen bozuklukların gelişmesini ve ilerlemesini etkili bir şekilde önleyebilir⁴. Bununla birlikte, BBB’nin benzersiz fizyolojik özellikleri, küçük moleküllü ilaçların% 98’inden fazlasının ve makromoleküler farmasötiklerin% 100’ünün merkezi sinir sistemine girmesini önler⁵. Bu nedenle, merkezi sinir sistemi için ilaçların geliştirilmesi sırasında ilaçların BBB yoluyla penetrasyonunun arttırılması, terapötik etkinliğin elde edilmesi için esastır ^6,7. Substratların bilgisayar simülasyonu taraması, ilaç adaylarının BBB’yi geçme olasılığını önemli ölçüde artırmış olsa da, bilimsel araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için hala güvenilir ve uygun fiyatlı in vitro/in vivo BBB modellerine ihtiyaç vardır⁸.

Yüksek verimli ilaç taraması için hızlı ve uygun fiyatlı bir teknik, in vitro model^9’dur. İlaçların BBB fonksiyonu üzerindeki etkilerinin temel süreçlerine ve hastalığın gelişimi ve ilerlemesindeki rollerine ışık tutmak için bir dizi basitleştirilmiş in vitro BBB modeli oluşturulmuştur. Şu anda, yaygın in vitro BBB modelleri, vasküler endotel hücreleri ve astrositler, perisitler veya mikroglia^13,14 tarafından oluşturulan tek katmanlı, ko-kültür, dinamik ve mikroakışkan modellerdir 10,11,12. Her ne kadar 3D hücre kültürleri BBB^15’in fizyolojik yapısı ile daha uyumlu olsa da, BBB için bir ilaç tarama aracı olarak uygulamaları, karmaşık tasarımları ve ortalamanın altında tekrarlanabilirlikleri nedeniyle hala kısıtlanmaktadır. Buna karşılık, tek katmanlı in vitro model, BBB’yi araştırmak için en sık kullanılan modeldir ve belirli hücrelerde membran taşıyıcılarının ve sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu belirlemek için uygulanabilir.

Transmembran elektrik direnci (TEER) ölçümü, direnç boyunca hücre katmanını değerlendirmek ve izlemek ve bariyerin hücre bütünlüğünü ve geçirgenliğini değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Tek tabakanın her iki tarafındaki büyüme ortamına veya tampon çözeltisine aynı anda iki elektrot yerleştirerek, hücrenin kompakt tabakası^16,17 boyunca alternatif akımı veya elektrik empedansını ölçmek mümkündür. İn vitro BBB modelinin uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını belirlemek için, TEER ölçümü genellikle altın standart¹⁸ olarak kullanılacaktır. Öte yandan, BBB geçirgenliği üzerindeki ilaç etkisinin eğilimi, ilaç tutulumundan sonra hücre tabakasının elektrik direncindeki değişimin ölçülmesiyle doğru bir şekilde tahmin edilebilir¹⁹. Örneğin, Feng ve ark. katalpolün (rehmanniae’nin birincil aktif monomeri), BBB’deki sıkı bağlantı proteinlerinin lipopolisakkarit kaynaklı aşağı regülasyonunu etkili bir şekilde tersine çevirebileceğini ve fare beyni endotel hücre tabakasının^{TEER değerini 20} yükseltebileceğini keşfetti.

Nöroinflamatuar yanıt genellikle BBB homeostaz dengesizliğinin ana nedenidir²¹. Nöroinflamatuar hasarı indüklemek için hipoksik tedavi, esas olarak fiziksel yöntemler ve kimyasal reaktif yöntemleri dahil olmak üzere kan-beyin bariyerini yok etmenin ana yöntemidir. İlki, hipoksik koşulları²² simüle etmek için hücre büyüme ortamındaki oksijen içeriğini değiştirmek için öncelikle üç gazlı bir inkübatör kullanırken, ikincisi, CoCl₂ gibi deoksi reaktiflerinin hücre kültürü ortamına²³ yapay olarak sokulmasıyla elde edilir. Fe^{2 +} Co^{2 +} ile ikame edilirse hücreler oksijensiz bir durumda kalacaktır 2 + heme’de. Katalitik grupta Co²⁺ yerine Fe2⁺ ikame edilirse, prolin hidroksilaz ve aspartat hidroksilaz aktivitesi inhibe edilecek ve hipoksi ile indüklenebilir faktör-1α (HIF-1α) birikimine neden ^olacaktır24. Kalıcı hipoksi altında, sitoplazmada HIF-1α’nın fosforilasyonu hücre ölümünü tetikler ve sonuçta vasküler geçirgenliği artıran vasküler endotelyal büyüme faktörünü aktive eder. Önceki çalışmalarda ^25,26, hipoksinin BBB’nin geçirgenliğini artırmak için endotelyal sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu önemli ölçüde azaltabileceği iyi gösterilmiştir. Bu çalışmada, basit bir BBB modeli oluşturmak için 24 oyuklu plakalara ekilen bEnd.3 hücrelerinin zaman-direnç eğrisi ölçülmüştür. Bu modeli kullanarak, BBB koruması için ilaçları taramak için kullanılabilecek bir hücre modeli oluşturmak için CoCl₂ müdahalesinden sonra hücre TEER’sindeki değişiklikleri karakterize ettik.