تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم
Summary
يصف هذا البروتوكول نموذجا يمكن الاعتماد عليه وفعالا في المختبر لحاجز الدم في الدماغ. تستخدم الطريقة الخلايا البطانية الوعائية الدماغية للفأر bEnd.3 وتقيس المقاومة الكهربائية عبر الغشاء.
Abstract
الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو هيكل فسيولوجي ديناميكي يتكون من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة والخلايا النجمية والخلايا المحيطة. من خلال تنسيق التفاعل بين العبور المقيد للمواد الضارة ، وامتصاص المغذيات ، وإزالة المستقلب في الدماغ ، فإن BBB ضروري في الحفاظ على توازن الجهاز العصبي المركزي. يعد بناء نماذج في المختبر من BBB أداة قيمة لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات العصبية وإنشاء علاجات دوائية. تصف هذه الدراسة إجراء لإنشاء نموذج خلية BBB أحادي الطبقة في المختبر عن طريق زرع خلايا bEnd.3 في الغرفة العلوية لصفيحة 24 بئرا. لتقييم سلامة وظيفة حاجز الخلية ، تم استخدام مقياس الفولتميتر الخلوي الظهاري التقليدي لتسجيل المقاومة الكهربائية عبر الغشاء للخلايا الطبيعية وخلايا نقص الأكسجين التي يسببها CoCl2 في الوقت الفعلي. نتوقع أن توفر التجارب المذكورة أعلاه أفكارا فعالة لإنشاء نماذج في المختبر من BBB والأدوية لعلاج اضطرابات أمراض الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
BBB هي واجهة بيولوجية فريدة بين الدورة الدموية والأنسجة العصبية ، والتي تتكون من الخلايا البطانية الوعائية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا النجمية ، والخلايا العصبية ، والهياكل الخلويةالأخرى 1. يتم تنظيم تدفق الأيونات والمواد الكيميائية والخلايا بين الدم والدماغ بشكل صارم بواسطة هذا الحاجز. يحمي هذا التوازن الأنسجة العصبية من السموم ومسببات الأمراض مع تمكين التشغيل المناسب لأعصاب الدماغ 2,3. يمكن أن يؤدي الحفاظ على سلامة BBB إلى منع تطور وتطور الاضطرابات التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي بشكل فعال ، مثل الخلل الوظيفي العصبي والوذمة والالتهاب العصبي4. ومع ذلك ، فإن الخصائص الفسيولوجية الفريدة ل BBB تمنع أكثر من 98٪ من الأدوية الجزيئية الصغيرة و 100٪ من الأدوية الجزيئية من دخول الجهاز العصبي المركزي5. لذلك ، فإن زيادة تغلغل الأدوية من خلال BBB أثناء تطوير الأدوية للجهاز العصبي المركزي أمر ضروري لتحقيق الفعالية العلاجية 6,7. على الرغم من أن فحص المحاكاة الحاسوبية للركائز قد زاد بشكل كبير من احتمال عبور الأدوية المرشحة ل BBB ، إلا أنه لا تزال هناك حاجة إلى نماذج BBB موثوقة وبأسعار معقولة في المختبر / في الجسم الحي لتلبية احتياجات البحث العلمي8.
تقنية سريعة وبأسعار معقولة لفحص الأدوية عالية الإنتاجية هي النموذج9 في المختبر. لإلقاء الضوء على العمليات الأساسية لتأثيرات الأدوية على وظيفة BBB ودورها في تطور المرض وتطوره ، تم إنشاء سلسلة من نماذج BBB المبسطة في المختبر. في الوقت الحاضر ، نماذج BBB الشائعة في المختبر هي النماذج أحادية الطبقة ، والثقافة المشتركة ، والديناميكية ، والموائع الدقيقة10،11،12 ، التي شيدتها الخلايا البطانية الوعائية والخلايا النجمية ، أو الخلايا المحيطة ، أو الخلايا الدبقية الصغيرة13،14. على الرغم من أن ثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد تتماشى بشكل أكبر مع التركيب الفسيولوجي ل BBB15 ، إلا أن تطبيقها كوسيلة لفحص الأدوية ل BBB لا يزال مقيدا بتصميمها المعقد واستنساخها دون المستوى. في المقابل ، فإن نموذج الطبقة الأحادية في المختبر هو النموذج الأكثر استخداما للبحث في BBB وهو قابل للتطبيق لتحديد تعبير ناقلات الغشاء وبروتينات الوصلة الضيقة في خلايا معينة.
قياس المقاومة الكهربائية عبر الغشاء (TEER) هو تقنية لتقييم ومراقبة طبقة الخلايا عبر المقاومة وتقييم سلامة الخلية ونفاذية الحاجز. من خلال إدخال قطبين كهربائيين في وقت واحد في وسط النمو أو محلول المخزن المؤقت على جانبي الطبقة الأحادية ، من الممكن قياس التيار المتردد أو المعاوقة الكهربائية من خلال الطبقة المدمجة للخلية16,17. من أجل تحديد ما إذا كان نموذج BBB في المختبر قد تم إنشاؤه بشكل صحيح ، سيتم استخدام قياس TEER عادة كمعيار ذهبي18. من ناحية أخرى ، يمكن التنبؤ بدقة باتجاه عمل الدواء على نفاذية BBB عن طريق قياس التغير في المقاومة الكهربائية لطبقة الخلية بعد إصابة الدواء19. على سبيل المثال ، اكتشف Feng et al. أن catalpol (المونومر النشط الأساسي ل rehmanniae) يمكن أن يعكس بشكل فعال التنظيم السفلي الناجم عن عديد السكاريد الشحمي لبروتينات الوصلات الضيقة في BBB ويرفع قيمة TEER لطبقة الخلايا البطانية لدماغ الفأر20.
عادة ما تكون الاستجابة الالتهابية العصبية هي السبب الرئيسي لاختلال توازن BBB21. علاج نقص الأكسجين للحث على إصابة التهاب الأعصاب هو الطريقة الرئيسية لتدمير الحاجز الدموي الدماغي ، بما في ذلك الطرق الفيزيائية وطرق الكاشف الكيميائي. يستخدم الأول في المقام الأول حاضنة ثلاثية الغازات لتغيير محتوى الأكسجين في بيئة نمو الخلايا لمحاكاة ظروف نقص الأكسجين22 ، بينما يتم تحقيق الأخير عن طريق إدخال كواشف deoxy بشكل مصطنع مثل CoCl2 إلى وسط زراعة الخلايا23. ستبقى الخلايا في حالة غير مؤكسجة إذا تم استبدال Fe2+ ب Co2+ في الهيم. إذا تم استبدال Fe2+ ب Co2+ في المجموعة التحفيزية ، تثبيط نشاط هيدروكسيلاز البرولين وهيدروكسيلاز الأسبارتات ، مما يؤدي إلى تراكم العامل المحرض لنقص الأكسجة -1α (HIF-1α)24. في ظل نقص الأكسجة المستمر ، يؤدي نزع الفسفرة من HIF-1α في السيتوبلازم إلى موت الخلايا وينشط عامل نمو بطانة الأوعية الدموية ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية. في الدراسات السابقة25،26 ، ثبت جيدا أن نقص الأكسجة يمكن أن يقلل بشكل كبير من التعبير عن بروتينات الوصلات الضيقة البطانية لزيادة نفاذية BBB. في هذه الدراسة ، تم قياس منحنى مقاومة الوقت لخلايا bEnd.3 المصنفة في 24 لوحة بئر من أجل إنشاء نموذج BBB مباشر. باستخدام هذا النموذج ، قمنا بتمييز التغييرات في TEER الخلوي بعد تدخل CoCl2 من أجل بناء نموذج خلية يمكن استخدامه لفحص الأدوية لحماية BBB.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحد أكثر أعضاء الجسم تطورا ، يتحكم الدماغ في مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية المعقدة ، بما في ذلك الذاكرة والإدراك والسمع والشم والحركة27. الدماغ هو واحد من أكثر أعضاء جسم الإنسان تعقيدا ومرضا في نفس الوقت. يظهر حدوث العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي ميلا متزايدا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر الدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274207 و 82104533) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي في نينغشيا (2023BEG02012) ، ومشروع تعزيز أبحاث Xinglin Scholar التابع لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
