Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

A BHE é uma interface biológica única entre a circulação sanguínea e o tecido nervoso, que é composto por células endoteliais vasculares, pericitos, astrócitos, neurônios e outras estruturas celulares¹. O fluxo de íons, produtos químicos e células entre o sangue e o cérebro é estritamente regulado por essa barreira. Essa homeostase protege os tecidos nervosos contra toxinas e patógenos, além de permitir o funcionamento adequado dos nervos cerebrais ^2,3. A manutenção da integridade da BHE pode efetivamente prevenir o desenvolvimento e a progressão de distúrbios que afetam o sistema nervoso central, como disfunção neuronal, edema e neuroinflamação⁴. No entanto, as propriedades fisiológicas únicas da BHE impedem que mais de 98% dos medicamentos de pequenas moléculas e 100% dos fármacos macromoleculares entrem no sistema nervoso central⁵. Portanto, aumentar a penetração de medicamentos através da BHE durante o desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central é essencial para alcançar a eficácia terapêutica ^6,7. Embora a triagem de substratos por simulação computacional tenha aumentado significativamente a probabilidade de candidatos a fármacos cruzarem o BBB, modelos de BBB confiáveis e acessíveis in vitro/in vivo ainda são necessários para atender às necessidades da pesquisa científica⁸.

Uma técnica rápida e acessível para triagem de fármacos em alto rendimento é o modelo in vitro ⁹. Para lançar luz sobre os processos fundamentais dos efeitos dos medicamentos na função BBB e sua participação no desenvolvimento e progressão da doença, uma série de modelos simplificados in vitro de BBB foi criada. Atualmente, os modelos de BHE in vitro comuns são os modelos monocamada, co-cultura, dinâmico e microfluídico 10,11,12, construídos por células endoteliais vasculares e astrócitos, pericitos ou micróglia ^13,14. Embora as culturas de células 3D estejam mais alinhadas com a estrutura fisiológica do BBB¹⁵, sua aplicação como meio de triagem de drogas para BBB ainda é limitada por seu design intrincado e reprodutibilidade inferior. Em contraste, o modelo in vitro de monocamada é o mais frequentemente utilizado para pesquisar a BBB e é aplicável para determinar a expressão de transportadores de membrana e proteínas de junção apertada em células específicas.

A medição da resistência elétrica transmembrana (TEER) é uma técnica para avaliar e monitorar a camada de células através da resistência e avaliar a integridade celular e a permeabilidade da barreira. Inserindo-se simultaneamente dois eletrodos no meio de crescimento ou solução tampão de cada lado da monocamada, é possível medir a corrente alternada ou a impedância elétrica através da camada compacta da célula ^16,17. Para determinar se o modelo de BBB in vitro foi adequadamente criado, a mensuração do TEER será usualmente empregada como padrão-ouro¹⁸. Por outro lado, a tendência da ação do medicamento sobre a permeabilidade da BHE pode ser predita com precisão medindo-se a mudança na resistência elétrica da camada celular após o envolvimento da droga¹⁹. Por exemplo, Feng e col. descobriram que o catalpol (o monômero ativo primário de rehmanniae) poderia efetivamente reverter a regulação negativa induzida por lipopolissacarídeo de proteínas de junção apertada no BBB e aumentar o valor TEER da camada de células endoteliais cerebrais de camundongos²⁰.

A resposta neuroinflamatória costuma ser a principal causa de desequilíbrio da homeostase BBB²¹. O tratamento hipóxico para induzir lesão neuroinflamatória é o principal método para destruir a barreira hematoencefálica, incluindo principalmente métodos físicos e métodos de reagentes químicos. A primeira utiliza primariamente uma incubadora de três gases para variar o conteúdo de oxigênio no ambiente de crescimento celular para simular condições hipóxicas²², enquanto a segunda é obtida pela introdução artificial de reagentes desoxi como a CoCl₂ no meio de cultura celular²³. As células permanecerão em uma condição desoxigenada se Fe²⁺ for substituído por Co²⁺ no heme. Se o Fe²⁺ for substituído por Co²⁺ no grupo catalítico, a atividade da prolina hidroxilase e do aspartato hidroxilase será inibida, resultando em um acúmulo do fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α)²⁴. Sob hipóxia persistente, a desfosforilação do HIF-1α no citoplasma desencadeia a morte celular e ativa o fator de crescimento endotelial vascular, o que, em última instância, eleva a permeabilidade vascular. Em estudos prévios^25,26, foi bem demonstrado que a hipóxia pode reduzir significativamente a expressão de proteínas de tight junction endotelial para aumentar a permeabilidade da BHE. Neste estudo, a curva de resistência temporal de células bEnd.3 semeadas em placas de 24 poços foi medida para criar um modelo de BBB simples. Usando este modelo, caracterizamos as mudanças na célula TEER após a intervenção com CoCl₂, a fim de construir um modelo celular que possa ser usado para rastrear drogas para proteção BBB.