Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale

La BBB è un’interfaccia biologica unica tra la circolazione sanguigna e il tessuto nervoso, composto da cellule endoteliali vascolari, periciti, astrociti, neuroni e altre strutture cellulari¹. Il flusso di ioni, sostanze chimiche e cellule tra il sangue e il cervello è strettamente regolato da questa barriera. Questa omeostasi protegge i tessuti nervosi dalle tossine e dagli agenti patogeni, consentendo anche il corretto funzionamento dei nervi cerebrali ^2,3. Mantenere l’integrità della BBB può prevenire efficacemente lo sviluppo e la progressione di disturbi che colpiscono il sistema nervoso centrale, come la disfunzione neuronale, l’edema e la neuroinfiammazione⁴. Tuttavia, le proprietà fisiologiche uniche della BBB impediscono a oltre il 98% dei farmaci a piccole molecole e al 100% dei farmaci macromolecolari di entrare nel sistema nervoso centrale⁵. Pertanto, aumentare la penetrazione dei farmaci attraverso la BBB durante lo sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale è essenziale per raggiungere l’efficacia terapeutica ^6,7. Anche se lo screening con simulazione al computer dei substrati ha aumentato significativamente la probabilità che i candidati farmaci attraversino la BEE, sono ancora necessari modelli di BBB in vitro/in vivo affidabili e convenienti per soddisfare le esigenze della ricerca scientifica⁸.

Una tecnica rapida ed economica per lo screening dei farmaci ad alto rendimento è il modello in vitro ⁹. Per far luce sui processi fondamentali degli effetti dei farmaci sulla funzione della BBB e sul loro ruolo nello sviluppo e nella progressione della malattia, è stata creata una serie di modelli semplificati di BBB in vitro. Attualmente, i modelli comuni di BBB in vitro sono i modelli monostrato, di co-coltura, dinamici e microfluidici 10,11,12, costruiti da cellule endoteliali vascolari e astrociti, periciti o microglia ^13,14. Sebbene le colture cellulari 3D siano più in linea con la struttura fisiologica della BBB¹⁵, la loro applicazione come mezzo di screening farmacologico per la BBB è ancora limitata dal loro design intricato e dalla riproducibilità scadente. Al contrario, il modello monostrato in vitro è quello più frequentemente utilizzato per la ricerca sulla BBB ed è applicabile per determinare l’espressione dei trasportatori di membrana e delle proteine a giunzione stretta in particolari cellule.

La misurazione della resistenza elettrica transmembrana (TEER) è una tecnica per valutare e monitorare lo strato di cellule attraverso la resistenza e valutare l’integrità cellulare e la permeabilità della barriera. Inserendo contemporaneamente due elettrodi nel mezzo di crescita o nella soluzione tampone su entrambi i lati del monostrato, è possibile misurare la corrente alternata o l’impedenza elettrica attraverso lo strato compatto della cella^16,17. Al fine di determinare se il modello BBB in vitro è stato creato correttamente, la misurazione del TEER sarà solitamente impiegata come gold standard¹⁸. D’altra parte, l’andamento dell’azione dei farmaci sulla permeabilità della BBB può essere previsto con precisione misurando la variazione della resistenza elettrica dello strato cellulare dopo il coinvolgimento del farmaco¹⁹. Ad esempio, Feng et al. hanno scoperto che il catalpol (il monomero attivo primario delle rehmanniae) potrebbe invertire efficacemente la down-regulation indotta dai lipopolisaccaridi delle proteine a giunzione stretta nella BBB e aumentare il valore TEER dello strato²⁰ delle cellule endoteliali del cervello di topo.

La risposta neuroinfiammatoria è di solito la causa principale dello squilibrio dell’omeostasi della BBB²¹. Il trattamento ipossico per indurre lesioni neuroinfiammatorie è il metodo principale per distruggere la barriera emato-encefalica, includendo principalmente metodi fisici e metodi di reagenti chimici. Il primo utilizza principalmente un incubatore a tre gas per variare il contenuto di ossigeno nell’ambiente di crescita cellulare per simulare le condizioni ipossiche²², mentre il secondo si ottiene introducendo artificialmente reagenti deossi come CoCl₂ nel terreno di coltura cellulare²³. Le cellule rimarranno in una condizione di deossigenazione se Fe²⁺ viene sostituito con Co²⁺ nell’eme. Se Fe²⁺ viene sostituito con Co²⁺ nel gruppo catalitico, l’attività della prolina idrossilasi e dell’aspartato idrossilasi sarà inibita, con conseguente accumulo di fattore 1α inducibile dall’ipossia (HIF-1α)²⁴. In condizioni di ipossia persistente, la defosforilazione di HIF-1α nel citoplasma innesca la morte cellulare e attiva il fattore di crescita dell’endotelio vascolare, che alla fine aumenta la permeabilità vascolare. In precedenti studi ^25,26, è stato ben dimostrato che l’ipossia può ridurre significativamente l’espressione delle proteine endoteliali della giunzione stretta per aumentare la permeabilità della BBB. In questo studio, è stata misurata la curva tempo-resistenza delle cellule bEnd.3 seminate in piastre a 24 pozzetti al fine di creare un modello BBB semplice. Utilizzando questo modello, abbiamo caratterizzato i cambiamenti nel TEER cellulare dopo l’intervento di CoCl₂ al fine di costruire un modello cellulare che può essere utilizzato per lo screening dei farmaci per la protezione della BBB.