El siguiente protocolo presenta la detección de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular utilizando la sincronización del ciclo celular seguida de la tinción inmunofluorescente de RPA2.
El ADN tiene vías de reparación celular específicas capaces de hacer frente a las lesiones que podrían surgir tanto de fuentes endógenas como exógenas. La reparación del ADN requiere la colaboración entre numerosas proteínas, responsables de cubrir una amplia gama de tareas, desde el reconocimiento y la señalización de la presencia de una lesión en el ADN hasta su reparación física. Durante este proceso, a menudo se crean rastros de ADN monocatenario (ssDNA), que finalmente son llenados por ADN polimerasas. La naturaleza de estas huellas de ssDNA (en términos de longitud y número), junto con la polimerasa reclutada para llenar estos vacíos, son específicas de la vía de reparación. La visualización de estas huellas de ssDNA puede ayudarnos a comprender la complicada dinámica de los mecanismos de reparación del ADN.
Este protocolo proporciona un método detallado para la preparación de células sincronizadas G1 para medir la formación de focos de ADNss en caso de estrés genotóxico. Utilizando un enfoque de inmunofluorescencia fácil de utilizar, visualizamos el ssDNA mediante la tinción de RPA2, un componente del complejo de replicación heterotrimérica de la proteína A (RPA). RPA2 se une y estabiliza los intermedios de ssDNA que surgen tras el estrés genotóxico o la replicación para controlar la reparación del ADN y la activación del punto de control del daño del ADN. La tinción con 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) se utiliza para visualizar la replicación del ADN y excluir cualquier célula de fase S. Este protocolo proporciona un enfoque alternativo a los ensayos convencionales basados en 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) no desnaturalizantes y es más adecuado para la detección de focos de ADNss fuera de la fase S.
Para mantener la vida, las células estudian y reparan constantemente el ADN para mantener su integridad genómica. Las células pueden acumular varios tipos de daño en el ADN debido a fuentes endógenas (p. ej., oxidación, alquilación, desaminación, errores de replicación) y exógenas (p. ej., UV, irradiación ionizante) de factores estresantes del ADN. La falta de reparación de estas lesiones da lugar a la apoptosis, la detención del ciclo celular o la senescencia y puede dar lugar a enfermedades1. Las lesiones del ADN pueden abordarse mediante cualquiera de las siguientes vías principales de reparación del ADN: DR (reparación de reversión directa), que repara principalmente las bases alquiladas2; BER (reparación por escisión de bases), que se dirige a los errores de bases de ADN no voluminosos y a las roturas de ADN monocatenario (SSB)3; NER (reparación por escisión de nucleótidos) que corrige lesiones voluminosas de ADN que distorsionan la hélice4; MMR (reparación de errores de emparejamiento) que se dirige principalmente a las discordancias de ADN, los bucles de inserción/deleción (IDL) y ciertos daños en la base5; NHEJ (unión de extremos no homólogos) y HRR (reparación de recombinación homóloga) que son activos en las roturas de ADN bicatenario (DSB)6; y TLS (síntesis translesional), que es un mecanismo de derivación de la lesión del ADN7. Aunque estas vías tienen distintas especificidades de sustrato, existen ciertas superposiciones entre ellas para garantizar la redundancia para una reparación eficiente. Comprender la acción de las diferentes vías de reparación del ADN en varias fases del ciclo celular es crucial, ya que estos factores de reparación del ADN podrían servir como objetivos esenciales para los enfoques terapéuticos para tratar el cáncer, el envejecimiento y los trastornos neurológicos 8,9.
El ADN monocatenario (ssDNA) se genera a lo largo del ciclo celular debido a la reparación de las lesiones del ADN generadas por agentes que dañan el ADN tanto endógenos como exógenos. Ante el estrés genotóxico, el ssDNA se genera abundantemente en las fases S y G2 donde HRR y MMR tienen su mayor actividad y cuando la maquinaria de replicación se detiene o colapsa al encontrarse con lesiones de ADN 6,10,11. Otras vías de reparación del ADN (p. ej., NHEJ/unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)/recocido monocatenario [SSA]) también generan ssDNA durante la reparación de DSB12. Estas trazas de ADNss suelen surgir de la resección del ADN, llevada a cabo por exonucleasas como EXO1, ADN2 y CtIP durante la FC y la MMR, endonucleasas como XPF y XPG durante la NER, o a través de la acción combinada de POLB y FEN1 durante la BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . Debido al trabajo de la maquinaria de replicación, también se generan rastros de ssDNA cuando las helicasas de ADN desenrollan el ADN frente a las polimerasas replicativas unidas a PCNA20. Por el contrario, en la fase G1, la falta de HRR y replicación del ADN y la actividad limitada de la MMR reducen la extensión de las huellas de ADNs generadas y, por lo tanto, son más difíciles de detectar 10,11,21.
Las trazas celulares de ssDNA son estructuras altamente sensibles que deben protegerse para evitar la formación de DSB. Esto se logra recubriendo las pistas de ssDNA con RPA. RPA es un abundante complejo proteico heterotriménico compuesto por múltiples subunidades (RPA1, RPA2 y RPA3, también denominadas RPA70, RPA32 y RPA14, respectivamente), que se expresan de forma ubicua a lo largo del ciclo celular22. Cada subunidad de RPA contiene un dominio de unión al ADN (DBD), capaz de interactuar con 4-6 nucleótidos, y las subunidades combinadas forman un núcleo de trimerización estable. En total, el RPA se une a aproximadamente 20-30 nucleótidos con afinidad subnanomolar23,24.
Los métodos convencionales utilizan microscopía de inmunofluorescencia (IF) para visualizar focos de ssDNA mediante el marcaje de 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) incorporado en el ADN genómico utilizando anticuerpos BrdU25. Este enfoque se basa en el hecho de que los anticuerpos BrdU solo pueden detectar BrdU en el ssDNA25 expuesto. Aunque este enfoque es sencillo, también muestra ciertas limitaciones. Por ejemplo, las células se tratan previamente para incorporar BrdU antes del inicio del experimento, lo que lleva mucho tiempo y puede interferir con los efectores posteriores. Por lo tanto, la detección de ssDNA basada en BrdU se limita a las células replicantes y no se puede utilizar para las células inactivas. Esto excluye la aplicación de este método para estudiar la reparación del ADN en células no replicantes, a pesar de su importancia en varias enfermedades como el cáncer y la neurodegeneración 5,26. Además, debido a que las estructuras de BrdU y EdU son muy similares, la mayoría de los anticuerpos BrdU muestran reactividad cruzada hacia EdU, lo que debe tenerse en cuenta cuando se apunta a experimentos de marcaje dual27. La tinción de RPA se ha utilizado previamente para mostrar focos de ssDNA principalmente en células de fase S; sin embargo, algunos trabajos también lo han utilizado con éxito fuera de la fase S 28,29,30,31,32,33,34,35. El siguiente protocolo utiliza eficientemente las propiedades de RPA, permitiendo la visualización de focos de ssDNA después del daño al ADN en la fase G1 del ciclo celular (aunque se puede usar en todas las fases del ciclo celular).
Mantener un cultivo celular sano y libre de micoplasma es fundamental para todos los experimentos descritos anteriormente. Las células RPE1 tienen una fuerte adhesión a los materiales plásticos tratados con cultivo de tejidos en medios de cultivo normales; sin embargo, sus características de unión disminuyen significativamente cuando se mantienen en condiciones libres de suero. Además, para capturar imágenes de alta resolución de focos de ADNss bajo un microscopio, las células deben colocarse en un cubreobjetos de 0,17 mm de grosor, que no es lo suficientemente hidrófilo como para soportar la unión adecuada de las células RPE1. Sin células correctamente aplanadas y distribuidas uniformemente, es muy difícil visualizar los focos individuales de ADNs. Por lo tanto, es fundamental elegir el material de recubrimiento adecuado (por ejemplo, vitronectina) y dejar el tiempo adecuado (6-12 h) para que las células se extiendan y se adhieran después de liberarlas en la fase G1.
Una parte desafiante del protocolo es obtener células RPE1 sincronizadas con G1 homogéneas. Esto requiere dos pasos críticos. En primer lugar, para una inanición sérica eficaz, las células deben tripsinizarse, lavarse a fondo con PBS y sembrarse directamente en nuevas placas de cultivo de tejidos utilizando medios sin suero. Lavar las células directamente en placas de cultivo de tejidos para eliminar el suero no producirá una sincronización eficiente de G0. En segundo lugar, cuando se liberan células en la fase G1, las células deben tripsinizarse nuevamente y sembrarse en placas de cultivo de tejidos frescos. Del mismo modo, el simple hecho de cambiar el medio y añadir un medio de cultivo que contenga suero a las células no dará lugar a una entrada G1 sincrónica. Además, para una entrada adecuada de G1, la densidad de siembra de las células en los cubreobjetos recubiertos debe estar en ciertos niveles de confluencia. Si bien la sincronización celular perfecta es generalmente inalcanzable, este protocolo de sincronización descrito aquí da una población G1 pura de ~ 97%. La densidad de siembra recomendada para RPE1 en un cubreobjetos de 12 mm de diámetro es de ~4 × 104 para adquirir un campo de visión homogéneo para la obtención de imágenes, con aproximadamente un 70% de confluencia. Una mayor densidad de siembra hace que las células se desprendan y se “despeguen” después de la extracción de CSK y dará como resultado una señal de fondo más alta durante la adquisición de imágenes.
Para reducir cualquier señal de fondo y lograr una relación señal-ruido favorable, es esencial lavar a fondo después de la incubación de anticuerpos primarios y secundarios. Dado que se deben aplicar numerosos pasos de lavado, también es esencial evitar que el pozo se seque durante cada paso de lavado. Minimizamos este artefacto aplicando un mínimo de 0,05% de Triton X-100 en todos los pasos de lavado e incubación. Una vez que los pozos se secaron, las celdas mostraron una relación señal-ruido alterada; Esto conduce a un patrón similar a un mosaico bajo el microscopio y podría interferir con la evaluación. La adquisición de imágenes de pila Z combinada con la deconvolución puede ayudar a capturar focos en diferentes planos focales para mejorar el análisis.
Los métodos convencionales se basan en la detección de BrdU incorporado en condiciones no desnaturalizantes. Estos métodos, sin embargo, dependen del pretratamiento de las células con altas dosis de BrdU durante al menos 1-2 días (o tiempo equivalente a un ciclo celular completo en la línea celular utilizada) para garantizar una incorporación genómica uniforme. Indeseablemente, la incorporación extensiva de BrdU puede causar interferencia en el ciclo celular36. Para abordar estas limitaciones, este método utiliza RPA2 endógeno para detectar focos de ssDNA. Este enfoque no requiere la incorporación de BrdU impulsada por la replicación, también se puede utilizar en células postmitóticas. Dado que no es necesaria una incorporación extensa de BrdU, esto ahorra tiempo y reduce la complejidad experimental. Mediante el uso de la tinción de RPA2 para visualizar el ssDNA, podemos utilizar la 2′-desoxi-5-etiniluridina (EdU) y la química del clic para marcar la replicación del ADN evitando la posible reactividad cruzada de los anticuerpos BrdU contra el EdU 27,37,38. Se debe tener especial cuidado de enmascarar adecuadamente el EdU incorporado durante la reacción de clic para que los anticuerpos BrdU no reaccionen de forma cruzada con EdU27,39.
Por último, una ventaja importante de utilizar RPA2 en lugar de BrdU es simplemente tener una relación señal-ruido superior en comparación con la tinción de BrdU fuera de la fase S. Descubrimos que la tinción de BrdU no desnaturalizante y su capacidad para visualizar el ssDNA está restringida a la fase S incluso en células replicantes (Figura 2). El anticuerpo BrdU se une solo al BrdU suficientemente expuesto en tramos de ADNss. La unión de las proteínas de reparación, incluida la RPA2, a los tramos de ssDNA puede suprimir o dificultar la exposición suficiente de BrdU en el ssDNA. También encontramos que la preextracción de CSK es necesaria para la visualización del ssDNA utilizando el anticuerpo BrdU. Esto es posible porque las trazas de ssDNA no son accesibles para el anticuerpo sin eliminar de ellas los componentes proteicos ligeramente unidos.
No obstante, existen algunas limitaciones asociadas a este protocolo. Una limitación del uso de RPA2 para la detección de ssDNA es la necesidad de optimizar el paso previo a la extracción de CSK. Sin unir, el exceso de RPA2 debe eliminarse del ADN antes de fijar las células. Por un lado, la subextracción conduce a un alto fondo debido a la fracción de proteína RPA2 que no está unida al ssDNA. Por otro lado, la sobreextracción provocará la pérdida de señal. Para la detección de BrdU, esto no es una variable, ya que BrdU se incorpora de manera estable al ADN y no se puede lavar mediante la extracción previa. Por lo tanto, se debe considerar cuidadosamente el tiempo de la preextracción de CSK, la cantidad de Triton X-100 en el tampón, el volumen y la temperatura a la que se realiza la preextracción. La preextracción de CSK también limita el uso del tamaño del núcleo para discriminar las células G0/G1 de las células S/G2.
Además, no podemos excluir la posibilidad de que parte de la señal que proviene de RPA2 se origine al unirse a otros interactores de proteínas de unión a la cromatina. También hay que tener en cuenta la especificidad de especie del anticuerpo RPA2. El anticuerpo utilizado en este protocolo puede reconocer RPA2 en humanos, ratones, ratas, hámsteres y monos. Otra limitación de este enfoque es que no todas las líneas celulares pueden carecer de suero para la sincronización de G0. La mayoría de las líneas celulares cancerosas pueden eludir los puntos de control del ciclo celular y proliferar incluso en medios privados de suero. Aunque la inanición del suero es beneficiosa, ya que no causa daño en el ADN, se debe monitorear cuidadosamente la eficiencia de la sincronización celular para asegurarse de que se logre el enriquecimiento adecuado de la fase del ciclo celular. Para las células que no responden a la privación sérica, se deben considerar otros métodos de sincronización celular (p. ej., sacudida mitótica, inhibición de CDK1 para la detención de G2 o técnicas no invasivas como la elutriación centrífuga). Otro método posible es el uso de imágenes de alto contenido para medir el contenido de EdU y ADN nuclear para el perfil del ciclo celular de células asíncronas31. Hay que tener en cuenta las implicaciones de utilizar métodos de sincronización alternativos para evitar interferencias con el análisis posterior. Por ejemplo, el uso de doble bloqueo de timidina o afidicolina, a menudo utilizado en la literatura, dará lugar a estrés de replicación y daño en el ADN40.
La investigación de los mecanismos de reparación del ADN sigue siendo un punto focal de discusión en los campos del cáncer y la biología celular. El protocolo presentado aquí ofrece un enfoque valioso para la preparación de células, lo que permite la visualización y el análisis cuantitativo del ssDNA tras la exposición a agentes que dañan el ADN. En particular, este protocolo destaca la utilización de la proteína de unión al ADNss, RPA2, demostrando su alta especificidad para visualizar pequeñas cantidades de focos de ADNss, evitando al mismo tiempo la reactividad cruzada no deseada en todas las fases del ciclo celular. El uso de RPA2 confiere numerosas ventajas, especialmente para los investigadores que pretenden analizar células en la fase G1 del ciclo celular. Este protocolo tiene en cuenta varias limitaciones y aborda las preocupaciones relacionadas con la interferencia de la señal, el ruido de fondo no deseado y la reactividad cruzada cuando se utiliza la tinción de RPA2 o BrdU para detectar ssDNA.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a Michele Pagano por su apoyo y sus útiles ideas, a Ashley Chui y Sharon Kaisari por la lectura crítica del manuscrito, y a Jeffrey Estrada y Vilma Díaz por su continuo apoyo. Este trabajo fue apoyado por un suplemento de diversidad de la GM136250 de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud.
Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analog |
Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |