以下方案介绍了利用细胞周期同步和RPA2免疫荧光染色检测细胞周期G1期的单链DNA病灶。
DNA具有专用的细胞修复途径,能够应对可能来自内源性和/或外源性来源的病变。DNA修复需要众多蛋白质之间的协作,负责涵盖广泛的任务,从识别DNA损伤的存在并发出信号到物理修复它。在此过程中,通常会产生单链 DNA (ssDNA) 的轨迹,最终由 DNA 聚合酶填充。这些ssDNA轨迹的性质(就长度和数量而言),以及为填补这些空白而募集的聚合酶,是修复途径特异性的。这些ssDNA轨迹的可视化可以帮助我们理解DNA修复机制的复杂动力学。
该协议为制备G1同步细胞以测量遗传毒性应激时ssDNA病灶的形成提供了详细的方法。使用易于利用的免疫荧光方法,我们通过染色 RPA2(异源三聚体复制蛋白 A 复合物 (RPA) 的组成部分)来可视化 ssDNA。RPA2 结合并稳定遗传毒性应激或复制时产生的 ssDNA 中间体,以控制 DNA 修复和 DNA 损伤检查点激活。5-乙炔基-2′-脱氧尿苷 (EdU) 染色用于可视化 DNA 复制以排除任何 S 期细胞。该方案为传统的非变性5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)测定提供了一种替代方法,并且更适合检测S期外的ssDNA病灶。
为了维持生命,细胞不断调查和修复DNA,以保持其基因组完整性。由于DNA应激源的内源性(例如氧化、烷基化、脱氨化、复制错误)和外源性(例如紫外线、电离照射)来源,细胞可能会积累各种类型的DNA损伤。未能修复这些病变会导致细胞凋亡、细胞周期停滞或衰老,并可能导致疾病1。DNA损伤可以通过以下任何一种主要的DNA修复途径来解决:DR(直接逆转修复),主要修复烷基化碱基2;BER(碱基切除修复),针对非大块 DNA 碱基错误和单链 DNA 断裂 (SSB)3;NER(核苷酸切除修复)矫正体积庞大、螺旋扭曲的 DNA 损伤4;MMR(错配修复)主要针对 DNA 错配、插入/缺失环 (IDL) 和某些碱基损伤5;NHEJ(非同源末端连接)和 HRR(同源重组修复)在双链 DNA 断裂 (DSB) 处均具有活性6;TLS(跨病变合成),这是一种DNA病变旁路机制7。尽管这些途径具有不同的底物特异性,但它们之间存在某些重叠,以确保冗余以实现有效修复。了解不同 DNA 修复途径在不同细胞周期阶段的作用至关重要,因为这些 DNA 修复因子可以作为治疗癌症、衰老和神经系统疾病的治疗方法的重要靶标 8,9。
单链 DNA (ssDNA) 是由于内源性和外源性 DNA 损伤剂产生的 DNA 损伤的修复而在整个细胞周期中产生的。在遗传毒性应激下,ssDNA 在 HRR 和 MMR 活性最高的 S 期和 G2 期大量生成,当遇到 DNA 损伤时复制机制停滞或崩溃时 6,10,11。其他 DNA 修复途径(例如,NHEJ/微同源介导的末端连接 (MMEJ)/单链退火 [SSA])也在 DSB 修复过程中产生 ssDNA12。这些 ssDNA 轨迹通常来自 DNA 切除,由 HR 和 MMR 期间的 EXO1、DNA2 和 CtIP 等核酸外切酶、NER 期间的 XPF 和 XPG 等核酸内切酶或 BER4、13、14、15、16、17、18、19 期间的 POLB 和 FEN1 的联合作用进行.由于复制机制的工作,当DNA解旋酶在PCNA结合的复制聚合酶20前面展开DNA时,也会产生ssDNA轨迹。相反,在 G1 期,HRR 和 DNA 复制的缺乏以及 MMR 的有限活性降低了生成的 ssDNA 轨迹的范围,因此检测更具挑战性 10,11,21。
细胞 ssDNA 轨道是高度敏感的结构,必须加以保护以避免 DSB 的形成。这是通过用 RPA 涂覆 ssDNA 轨道来实现的。RPA 是一种丰富的异源三聚体蛋白复合物,由多个亚基(RPA1、RPA2 和 RPA3,也称为 RPA70、RPA32 和 RPA14)组成,它们在整个细胞周期中普遍表达22。每个 RPA 亚基都包含一个 DNA 结合域 (DBD),能够与 4-6 个核苷酸相互作用,组合后的亚基形成稳定的三聚体化核心。RPA 总共与大约 20-30 个核苷酸结合,具有亚纳摩尔亲和力23,24。
常规方法使用免疫荧光 (IF) 显微镜,通过使用 BrdU 抗体标记掺入基因组 DNA 中的 5-溴-2′-脱氧尿苷 (BrdU) 来可视化 ssDNA 病灶25。这种方法依赖于这样一个事实,即 BrdU 抗体只能检测暴露的 ssDNA25 中的 BrdU。尽管这种方法很简单,但它也显示出某些局限性。例如,在实验开始前对细胞进行预处理以掺入BrdU,这很耗时,并且会干扰下游效应器。因此,基于BrdU的ssDNA检测仅限于复制细胞,不能用于静止细胞。这不包括该方法在非复制细胞中研究DNA修复的应用,尽管它在癌症和神经退行性变等多种疾病中很重要5,26。此外,由于 BrdU 和 EdU 的结构非常相似,大多数 BrdU 抗体对 EdU 表现出交叉反应性,这在进行双标记实验时必须考虑27。RPA染色以前主要用于显示S期细胞中的ssDNA病灶;然而,一些论文也成功地在S阶段28,29,30,31,32,33,34,35之外使用它。以下方案有效地利用了RPA的特性,允许在细胞周期的G1期(尽管它可用于所有细胞周期阶段)中DNA损伤后的ssDNA病灶的可视化。
保持健康、无支原体的细胞培养对于上述所有实验都至关重要。在正常培养基下,RPE1细胞与组织培养处理的塑料器皿有很强的附着力;然而,当保持在无血清条件下时,它们的结合特性会显着减弱。此外,为了在显微镜下捕获 ssDNA 病灶的高分辨率图像,需要将细胞接种到 0.17 mm 厚的盖玻片上,该盖玻片的亲水性不足以支持 RPE1 细胞的正确附着。如果没有适当扁平和均匀分布的细胞,可视化单个 ssDNA 病灶是非常具有挑战性的。因此,选择合适的包衣材料(例如玻连蛋白)并在释放细胞进入 G1 期后留出足够的时间(6-12 小时)让细胞扩散和附着至关重要。
该方案的一个具有挑战性的部分是获得均质的 G1 同步 RPE1 细胞。这需要两个关键步骤。首先,为了有效地进行血清饥饿,需要对细胞进行胰蛋白酶消化,用PBS彻底洗涤,然后使用无血清培养基直接接种到新的组织培养皿上。直接在组织培养皿中洗涤细胞以去除血清不会产生有效的 G0 同步。其次,当将细胞释放到 G1 期时,必须再次将细胞胰蛋白酶消化并接种到新鲜的组织培养板上。同样,仅更换培养基并向细胞中添加含血清的培养基不会导致同步进入 G1。此外,为了正确进入 G1,镀膜盖玻片上细胞的接种密度必须处于一定的汇合度水平。虽然完美的细胞同步通常是无法实现的,但这里描述的这种同步方案给出了~97%的纯G1群体。RPE1 在直径为 12 mm 的盖玻片上的推荐接种密度为 ~4 × 104 ,以获得均匀的成像视野,汇合度约为 70%。较高的接种密度会导致细胞在CSK提取后分离和“剥离”,并在图像采集过程中产生更高的背景信号。
为了减少任何背景信号并获得有利的信噪比,在一抗和二抗孵育后彻底清洗至关重要。由于要应用许多洗涤步骤,因此在每个洗涤步骤中防止孔变干也很重要。我们通过在所有洗涤和孵育步骤中应用至少 0.05% 的 Triton X-100 来最大限度地减少这种伪影。一旦孔干涸,细胞的信噪比就会改变;这会导致显微镜下出现马赛克状图案,并可能干扰评估。Z-stack图像采集与反卷积相结合,可以帮助捕获不同焦平面的病灶,从而改善分析。
传统方法依赖于在非变性条件下检测掺入的BrdU。然而,这些方法依赖于用高剂量的BrdU对细胞进行至少1-2天的预处理(或相当于所用细胞系中一个完整的细胞周期的时间),以确保均匀的基因组掺入。不可取的是,广泛的 BrdU 掺入会导致细胞周期干扰36。为了解决这些局限性,该方法利用内源性 RPA2 检测 ssDNA 病灶。这种方法不需要复制驱动的BrdU掺入,它也可以用于有丝分裂后细胞。由于不需要大量掺入BrdU,因此可以节省时间并降低实验复杂性。通过使用 RPA2 染色来可视化 ssDNA,我们可以使用 2′-脱氧-5-乙炔基尿苷 (EdU) 和点击化学来标记 DNA 复制,同时避免针对 EdU27、37、38 的 BrdU 抗体可能出现交叉反应。在点击反应过程中,必须特别注意适当地掩盖掺入的 EdU,以便 BrdU 抗体不会与 EdU 发生交叉反应27,39。
最后,使用 RPA2 代替 BrdU 的一个重要好处是,与 S 期外的 BrdU 染色相比,具有更高的信噪比。我们发现,即使在复制细胞中,非变性BrdU染色及其可视化ssDNA的能力也仅限于S期(图2)。BrdU 抗体仅与 ssDNA 延伸中充分暴露的 BrdU 结合。修复蛋白(包括 RPA2)与 ssDNA 延伸的结合可能会抑制或阻碍 ssDNA 中 BrdU 的充分暴露。我们还发现,CSK预提取对于使用BrdU抗体进行ssDNA可视化是必要的。这是可能的,因为如果不从ssDNA轨迹中去除轻结合的蛋白质成分,抗体就无法访问ssDNA轨迹。
尽管如此,该协议仍存在一些限制。使用 RPA2 进行 ssDNA 检测的一个局限性是需要优化 CSK 预提取步骤。在固定细胞之前,必须从DNA中洗掉未结合的过量RPA2。一方面,由于 RPA2 蛋白组分不与 ssDNA 结合,欠提取导致高背景。另一方面,过度提取会导致信号丢失。对于BrdU检测,这不是一个变量,因为BrdU稳定地掺入DNA中,不能通过预提取洗掉。因此,必须仔细考虑CSK预萃取的时间,缓冲液中Triton X-100的量,体积和进行预萃取的温度。CSK 预提取还限制了使用细胞核大小来区分 G0/G1 细胞和 S/G2 细胞。
此外,我们不能排除来自RPA2的某些信号起源于它与其他染色质结合蛋白相互作用物结合的可能性。还必须考虑 RPA2 抗体的物种特异性。该协议中使用的抗体可以识别人、小鼠、大鼠、仓鼠和猴子 RPA2。这种方法的另一个局限性是,并非所有细胞系都可以进行血清饥饿以进行 G0 同步。大多数癌细胞系可以绕过细胞周期检查点,即使在血清剥夺的培养基中也能增殖。虽然血清饥饿是有益的,因为它不会导致DNA损伤,但必须仔细监测它们的细胞同步效率,以确保实现适当的细胞周期阶段富集。对于对血清剥夺无反应的细胞,必须考虑其他细胞同步方法(例如,有丝分裂甩除、CDK1 抑制 G2 阻滞或离心洗脱等非侵入性技术)。另一种可能的方法是使用高内涵成像来测量 EdU 和核 DNA 含量,用于异步细胞的细胞周期分析31。必须考虑使用替代同步方法防止干扰下游分析的影响。例如,使用文献中经常使用的双胸苷阻滞剂或阿菲二科林会导致复制应激和 DNA 损伤40。
DNA修复机制的研究仍然是癌症和细胞生物学领域讨论的焦点。这里介绍的方案为细胞的制备提供了一种有价值的方法,能够在暴露于DNA损伤剂时对ssDNA进行可视化和定量分析。值得注意的是,该协议强调了ssDNA结合蛋白RPA2的利用,证明了其高特异性,可以可视化少量ssDNA病灶,同时避免在所有细胞周期阶段产生不必要的交叉反应。使用 RPA2 具有许多优势,特别是对于旨在分析细胞周期 G1 期细胞的研究人员而言。该协议考虑了几个局限性,并解决了使用RPA2或BrdU染色检测ssDNA时与信号干扰,不需要的背景噪声和交叉反应性相关的问题。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢米歇尔·帕加诺(Michele Pagano)的支持和有益的见解,感谢阿什利·崔(Ashley Chui)和莎朗·凯萨里(Sharon Kaisari)对手稿的批判性阅读,以及杰弗里·埃斯特拉达(Jeffrey Estrada)和维尔玛·迪亚兹(Vilma Diaz)的持续支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院资助GM136250多样性补充的支持。
Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analog |
Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |