JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Visualisatie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus

Published: December 22, 2023
doi:
10.3791/65926
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,NYU Grossman School of Medicine, 2The Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center,NYU Langone Health, 3Department of Cell Biology,NYU Grossman School of Medicine, 4Howard Hughes Medical Institute,NYU Grossman School of Medicine, 5Institute of Enzymology, Centre of Excellence of the Hungarian Academy of Sciences,HUN-REN Research Centre for Natural Sciences

Summary

Het volgende protocol presenteert de detectie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus met behulp van celcyclussynchronisatie gevolgd door RPA2-immunofluorescerende kleuring.

Abstract

DNA heeft speciale cellulaire herstelroutes die in staat zijn om te gaan met laesies die kunnen ontstaan uit zowel endogene als / of exogene bronnen. DNA-reparatie vereist samenwerking tussen tal van eiwitten, die verantwoordelijk zijn voor het uitvoeren van een breed scala aan taken, van het herkennen en signaleren van de aanwezigheid van een DNA-laesie tot het fysiek repareren ervan. Tijdens dit proces ontstaan vaak sporen van enkelstrengs DNA (ssDNA), die uiteindelijk worden opgevuld door DNA-polymerasen. De aard van deze ssDNA-sporen (zowel in termen van lengte als aantal), samen met het polymerase dat wordt gerekruteerd om deze hiaten op te vullen, zijn specifiek voor reparatiepaden. De visualisatie van deze ssDNA-sporen kan ons helpen de gecompliceerde dynamiek van DNA-reparatiemechanismen te begrijpen.

Dit protocol biedt een gedetailleerde methode voor de bereiding van G1-gesynchroniseerde cellen om de vorming van ssDNA-foci bij genotoxische stress te meten. Met behulp van een eenvoudig te gebruiken immunofluorescentiebenadering visualiseren we ssDNA door te kleuren voor RPA2, een component van het heterotrimere replicatie-eiwit A-complex (RPA). RPA2 bindt zich aan en stabiliseert ssDNA-tussenproducten die ontstaan bij genotoxische stress of replicatie om DNA-herstel en activering van DNA-schade controlepunten te beheersen. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)-kleuring wordt gebruikt om DNA-replicatie te visualiseren om cellen in de S-fase uit te sluiten. Dit protocol biedt een alternatieve benadering voor de conventionele, niet-denaturerende 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU)-gebaseerde assays en is beter geschikt voor de detectie van ssDNA-foci buiten de S-fase.

Introduction

Om het leven in stand te houden, onderzoeken en repareren cellen voortdurend DNA om hun genomische integriteit te behouden. Cellen kunnen verschillende soorten DNA-schade accumuleren als gevolg van zowel endogene (bijv. oxidatie, alkylering, deaminatie, replicatiefouten) als exogene (bijv. UV, ioniserende bestraling) bronnen van DNA-stressoren. Het niet herstellen van deze laesies resulteert in apoptose, stopzetting van de celcyclus of senescentie en kan leiden tot ziekten. DNA-laesies kunnen worden aangepakt door een van de volgende belangrijke DNA-reparatieroutes: DR (direct reversal repair), dat voornamelijk gealkyleerde basen repareert2; BER (base excision repair), dat zich richt op niet-omvangrijke DNA-basenfouten en enkelstrengs DNA-breuken (SSB’s)3; NER (nucleotide excision repair) voor het corrigeren van omvangrijke, helix-vervormende DNA-laesies4; MMR (mismatch-reparatie) is voornamelijk gericht op DNA-mismatches, insertie-/deletielussen (IDL’s) en bepaalde basenbeschadigingen5; NHEJ (niet-homologe eindverbinding) en HRR (homologe recombinatiereparatie) die beide actief zijn bij dubbelstrengs DNA-breuken (DSB’s)6; en TLS (translaesiesynthese), een DNA-laesie-bypassmechanisme7. Hoewel deze paden verschillende substraatspecifieke kenmerken hebben, zijn er bepaalde overlappingen tussen hen om redundantie te garanderen voor efficiënt herstel. Het begrijpen van de werking van de verschillende DNA-herstelroutes in verschillende celcyclusfasen is cruciaal, aangezien deze DNA-herstelfactoren kunnen dienen als essentiële doelen voor therapeutische benaderingen voor de behandeling van kanker, veroudering en neurologische aandoeningen 8,9.

Enkelstrengs DNA (ssDNA) wordt gedurende de hele celcyclus gegenereerd als gevolg van de reparatie van DNA-laesies die worden gegenereerd door zowel endogene als exogene DNA-beschadigende stoffen. Bij genotoxische stress wordt ssDNA overvloedig gegenereerd in de S- en G2-fasen waar HRR en MMR hun hoogste activiteit hebben en wanneer de replicatiemachine vastloopt of instort bij het tegenkomen van DNA-laesies 6,10,11. Andere DNA-reparatieroutes (bijv. NHEJ/microhomologie-gemedieerde eindverbinding (MMEJ)/enkelstrengs gloeien [SSA]) genereren ook ssDNA tijdens DSB-reparatie12. Deze ssDNA-sporen komen meestal voort uit DNA-resectie, uitgevoerd door exonucleasen zoals EXO1, DNA2 en CtIP tijdens HR en MMR, endonucleasen zoals XPF en XPG tijdens NER, of door de gecombineerde werking van POLB en FEN1 tijdens BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . Door het werk van de replicatiemachines worden ssDNA-sporen ook gegenereerd wanneer de DNA-helicasen DNA afwikkelen voor de PCNA-gebonden replicatieve polymerasen20. In de G1-fase daarentegen vermindert het gebrek aan HRR en DNA-replicatie en de beperkte activiteit van MMR de omvang van de gegenereerde ssDNA-sporen en zijn ze daarom moeilijker te detecteren 10,11,21.

Cellulaire ssDNA-sporen zijn zeer gevoelige structuren die moeten worden beschermd om de vorming van DSB’s te voorkomen. Dit wordt bereikt door de ssDNA-tracks te coaten met RPA. RPA is een overvloedig heterotrimer eiwitcomplex dat bestaat uit meerdere subeenheden (RPA1, RPA2 en RPA3, ook wel respectievelijk RPA70, RPA32 en RPA14 genoemd), die alomtegenwoordig tot expressie worden gebracht gedurende de hele celcyclus22. Elke RPA-subeenheid bevat een DNA-bindend domein (DBD), dat in staat is om te interageren met 4-6 nucleotiden, en de gecombineerde subeenheden vormen een stabiele trimerisatiekern. In totaal bindt RPA zich aan ongeveer 20-30 nucleotiden met sub-nanomolaire affiniteit23,24.

Conventionele methoden maken gebruik van immunofluorescentie (IF)-microscopie om ssDNA-foci te visualiseren door 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) te labelen dat is opgenomen in het genomische DNA met behulp van BrdU-antilichamen25. Deze benadering is gebaseerd op het feit dat BrdU-antilichamen BrdU alleen kunnen detecteren in blootgesteld ssDNA25. Hoewel deze aanpak eenvoudig is, vertoont het ook bepaalde beperkingen. Cellen worden bijvoorbeeld voorbehandeld om BrdU op te nemen voor de start van het experiment, wat tijdrovend is en stroomafwaartse effectoren kan verstoren. Daarom is BrdU-gebaseerde ssDNA-detectie beperkt tot replicerende cellen en kan deze niet worden gebruikt voor slapende cellen. Dit sluit de toepassing van deze methode uit om DNA-herstel in niet-replicerende cellen te bestuderen, ondanks het belang ervan bij verschillende ziekten zoals kanker en neurodegeneratie. Bovendien, omdat de structuren van BrdU en EdU erg op elkaar lijken, vertonen de meeste BrdU-antilichamen kruisreactiviteit tegen EdU, waarmee rekening moet worden gehouden bij het streven naar experimenten met dubbele labeling27. RPA-kleuring is eerder gebruikt om ssDNA-foci aan te tonen, voornamelijk in cellen in de S-fase; sommige kranten hebben het echter ook met succes gebruikt buiten de S-fase 28,29,30,31,32,33,34,35. Het volgende protocol maakt efficiënt gebruik van de eigenschappen van RPA, waardoor de visualisatie van ssDNA-foci na DNA-schade in de G1-fase van de celcyclus mogelijk is (hoewel het in alle fasen van de celcyclus kan worden gebruikt).

Protocol

1. Onderhoud van hTERT-onsterfelijke retinale pigmentepitheelcellen (RPE1) Onderhoud RPE1-cellijnen in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (Hi-FBS) en 100 μg/ml penicilline-streptomycine (vanaf nu kweekmedium genoemd) in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 °C. Voor routinekweek kweekt u RPE1-cellen in een met weefselkweek behandelde schaal van 15 cm en splitst u deze bij het bereiken van 80-90% confluentie (~16-18 × 106 cellen per schaal van 15 cm). Verwijder bij het splitsen het medium en spoel de cellen met 10 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 3 ml 0,05% trypsine-EDTA toe om het hele oppervlak van de schaal te bedekken. Houd de cellen met de trypsine op 37 °C totdat ze loskomen. Na trypsinisatie de cellen resuspenderen met kweekmedium en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT, 22-25 °C) laten afkoelen bij 150 × g . Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen voorzichtig in 10 ml kweekmedium. Zaai 1,6-1,8 × 106 cellen in een nieuwe schaal van 15 cm (~1 ml van de celsuspensie).OPMERKING: Al het weefselkweekwerk moet worden uitgevoerd onder BSL-2-veiligheidsniveaus. De incubatietijd voor trypsinisatie hangt af van de samenvloeiing van cellen. Gewoonlijk duurt het proces 2-3 minuten om te voltooien voor een 90% confluente plaat. Cellen moeten regelmatig worden gescreend op Mycoplasma-besmetting met in de handel verkrijgbare kits (zie voorbeelden in de materiaaltabel). 2. siRNA-uitschakeling van het gen van belang (Indonesische overheid) Zaai 1,0 × 106 RPE1-cellen in een met weefselkweek behandelde plaat van 10 cm met 10 ml kweekmedium op de dag voor de transfectie. Complexeer op de dag van de transfectie het siRNA. Gebruik voor een plaat van 10 cm een eindconcentratie van 20 nM siRPA2 en 12 μL transfectiereagens op basis van lipiden in 500 μL transfectiemedium met een laag serumgehalte. Meng alle componenten voorzichtig door op de buis te tikken en incubeer gedurende 5 minuten bij RT (22-25 °C). Voeg het gecomplexeerde siRNA-mengsel druppelsgewijs toe aan de cellen en incubeer de cellen met het siRNA gedurende 48 uur. 3. Synchronisatie van RPE1-cellen in de G0-fase Probeer de RPE1-cellen uit stap 2.3 zoals beschreven in rubriek 1 (~2 × 106 cellen). Breng de celsuspensie over in centrifugebuisjes van 15 ml en centrifugeer deze bij 150 × g, RT (22-25 °C) gedurende 5 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in 12 ml PBS. Centrifugeer de cellen bij 150 × g bij RT (22-25 °C) gedurende 5 min. Herhaal het verwijderen van het supernatans en het centrifugeren twee keer. Resuspendeer de cellen in 10 ml serumvrije DMEM aangevuld met 100 μg/ml penicilline-streptomycine,  1 mM natriumpyruvaat, 15 mM HEPES, en leg ze op een weefselkweekschaal van 10 cm.OPMERKING: Als de cellen de neiging hebben om te klonteren, resuspendeer ze dan in slechts 1 ml serumvrije DMEM en pipetteer ze 5x op en neer met behulp van een P1000-tip om de klonten los te maken voordat u de suspensie verdunt tot een uiteindelijk volume van 10 ml. Na 24 uur serumuithongering de tweede uitschakelronde inleiden volgens dezelfde procedure als beschreven in rubriek 2 door het gecomplexeerde siRNA toe te voegen aan de serumhongercellen. Bewaar de RPE1-cellen 72 uur in serumvrije DMEM voordat u overgaat tot G1-afgifte. 4. Dekglaasje coating en het vrijgeven van cellen in G1-fase Steriliseer een pincet met 70% ethanol en plaats een enkel glazen dekglaasje (12 mm in diameter en #1,5 dikte [0,17 mm]) in een putje met een plaat met 24 putjes. Verdun de vitronectine-coatingmatrix met PBS om een eindconcentratie van 10 μg/ml te verkrijgen. Voeg 500 μl vitronectine-oplossing toe aan elk putje met de dekglaasjes en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Verwijder de coatingoplossing en was de dekglaasjes met 1 ml PBS. Maak de serumuitgehongerde RPE1-cellen los van de 10 cm weefselgekweekte behandelde plaat met 1 ml 0,05% trypsine na een PBS-wasbeurt gedurende 1 minuut bij 37 °C.OPMERKING: Cellen laten veel sneller los na uithongering van het serum. Wees voorzichtig bij het wassen van de cellen met PBS en gebruik korte trypsinisatietijden. Om de trypsine te inactiveren, resuspendeert u de RPE1-cellen in een totaal van 6 ml kweekmedium. Verwijder de geïnactiveerde trypsine door de cellen gedurende 5 minuten rond te draaien met 150 × g bij RT (22-25 °C). Resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium en meet het celaantal. Zaai 4 × 104 RPE1-cellen op het gecoate dekglaasje in een totaal van 500 μL kweekmedium.OPMERKING: Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cel hoger is dan 90% voordat u doorgaat met stroomafwaartse stappen. De levensvatbaarheid van de cellen kan snel worden beoordeeld door trypanblauwe kleuring tijdens de stap van het tellen van cellen. Na 6 uur plateren van de cellen in het kweekmedium, zullen de G0-vrijgekomen cellen zich in de vroege G1-fase bevinden. Voer experimenten uit in G1 in dit venster van 6-12 uur voordat de cellen de S-fase ingaan. Alvorens DNA-schade aan te brengen, pulseren de cellen met 10 μM 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) gedurende 30 minuten bij 37 °C, verdund in kweekmedium. Verwijder het medium dat EdU bevat en achtervolg de cellen met 10 μM thymidine gedurende 10 minuten bij 37 °C om te voorkomen dat er EdU-opname achterblijft tijdens de inductie van DNA-schade. Verwijder het medium met thymidine en behandel de cellen met 250 μM H2O2 gedurende 1 uur, verdund in kweekmedium. 5. Immunofluorescentiekleuring van ssDNA Was de cellen eenmaal met 1 ml RT (22-25 °C) PBS om het medium en de serumcomponenten te verwijderen.NOTITIE: Wees voorzichtig bij het wassen van de cellen om losraken en drogen te voorkomen. Verwerk niet veel putjes tegelijkertijd. Pre-extractie: Incubeer de gewassen cellen in 1 ml CSK-extractiebuffer (tabel 1) gedurende 5 minuten bij RT (22-25 °C).OPMERKING: CSK-pre-extractie verwijdert alle niet-chromatinegebonden eiwitten, inclusief oplosbaar RPA2.LET OP: Triton X-100 is schadelijk bij inslikken en kan huidirritatie en oogletsel veroorzaken. Verwijder de CSK-buffer uit de cellen en fixeer ze direct door 0,5 ml 3,6% paraformaldehyde-oplossing (in PBS) met 0,05% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij RT (22-25 °C) toe te voegen.LET OP: Het is belangrijk om 3,6% PFA uit 32% PFA-bouillon vers te bereiden. Paraformaldehyde kan ernstig oogletsel, huidirritatie en irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Was de cellen één keer met 1 ml PBS met 0,05% Triton X-100 om de PFA te verwijderen. Permeabiliseer de cellen verder met 1 ml PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende 15 minuten bij RT (22-25 °C). EdU click-IT reactie om replicerende cellen te visualiseren (S-fase)Verwijder de permeabilisatieoplossing en was de cellen 2x met 1 ml blokkeerbuffer (tabel 1).LET OP: Runderserumalbumine (BSA) kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Voeg 1 ml blokkeerbuffer toe (tabel 1) en schud de dekglaasjesplaat voorzichtig gedurende 10 minuten bij RT (22-25 °C). Verwijder de blokkeerbuffer en voeg 500 μL klikreactiecocktail met picolylazide 647 toe (tabel 1). Incubeer de dekglaasjes gedurende 30 minuten bij RT (22-25 °C) met behulp van zacht schommelen en voer stroomafwaartse incubaties uit in het donker.OPMERKING: Gebruik bij gebruik van BrdU-antilichamen het dubbele van de hoeveelheid (1 ml) en de tijd (60 min) voor de klikreactie zoals aanbevolen door de fabrikant om ervoor te zorgen dat de reactie verzadigd is en de opgenomen EdU is geëtiketteerd. Dit beperkt de kruisreactiviteit van de BrdU-antilichamen27. Verwijder het klikreactiemengsel en was de cellen 2x met PBS met 0,05% Triton X-100 gedurende 10 min bij RT (22-25 °C) (Figuur 1 en Figuur 2). Voeg 1 ml blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT (22-25 °C). U kunt de cellen ook een nacht in de blokkeerbuffer bij 4 °C houden. Breng primair antilichaam (anti-RPA2 rat, 1:1.000 verdunning) aan gedurende 2 uur bij RT (22-25 °C) in 250-500 μL blokkeerbuffer met zacht schommelen. Was de cellen 2x met PBS met 0,05% Triton X-100 om snel het grootste deel van de antilichaamoplossing te verwijderen. Blijf de cellen 3 x 10 minuten wassen met blokkeerbuffer bij RT (22-25 °C). Breng secundair antilichaam (anti-rat Alexa-488, 1:1.000 verdunning) aan in 250-500 μL blokkeerbuffer bij RT (22-25 °C) gedurende 2 uur met zacht schommelen. Was de cellen met blokkeerbuffer 2x om snel het grootste deel van het secundaire antilichaam te verwijderen. Blijf de cellen 3 x 10 minuten wassen met PBS met 0,05% Triton X-100 bij RT (22-25 °C). Om de verkleuring van de kernen tegen te gaan, worden de cellen eenmaal gewassen met PBS met 0,05% Triton X-100 en 1 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 10 minuten bij RT (22-25 °C). Was de cellen eenmaal met PBS gedurende 5 minuten bij RT (22-25 °C). Monteer het dekglas op microscoopglaasjes met behulp van 10 μL montagemedium/dekglaasje. Dompel de dekglaasjes voor montage in gedestilleerd water om eventuele zoutkristallen te verwijderen. Maak de volgende dag een beeld van de objectglaasjes en bewaar ze wekenlang bij 4 °C (Figuur 3). 6. Beeldacquisitie en kwantificering Om beelden vast te leggen, gebruikt u een beschikbare epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met routinematige filtersets om DAPI-, FITC- en Cy5-kanalen in beeld te brengen met een vergroting van ten minste 60-63x, een hoge numerieke apertuur en olieobjectieven om nucleaire brandpunten te visualiseren.OPMERKING: Optimale DAPI-excitatie is ~359 nm; Alexa 488 excitatie is ~ 488 nm; terwijl Alexa 647 excitatie ~647 nm is. Open afbeeldingsbestanden in Fiji/ImageJ voor beeldanalyse.Maak nucleaire maskers met behulp van de DAPI-kleuring (Figuur 4A-F en aanvullende video S1).Open de DAPI-afbeelding. Selecteer Proces | Verbeter het contrast en stel de verzadigde pixel in op 0,35. Klik op Verwerken | Binair | Converteren naar masker. Kies Binair | Vul gaten en klik op Analyseren | Analyseer deeltjes. Stel de grootte in op 10-Infinity. Klik in ROI-beheer op Alles weergeven. RPA2-brandpunten in de kern vinden (Figuur 4G,H en aanvullende video S1)Open de RPA2-afbeelding. Kies Proces | Zoek Maxima. Stel de prominentie in op een waarde die de RPA2-brandpunten markeert (tussen 500 en 750), waardoor deze van de achtergrond wordt gescheiden. Klik ten slotte op de knop Meten in ROI Manager. Bereken het totale aantal nucleaire ssDNA-foci door de waarde in de RawinDen-kolom te delen door 255 (de maximale waarde van de pixelintensiteit in elke foci). Voer statistische analyses uit met behulp van de statistische softwaretool van uw voorkeur.OPMERKING: Sluit alle EdU-positieve cellen en onjuist gesegmenteerde DAPI-maskers uit van de analyse.

Representative Results

Om de beperkingen van het detecteren van ssDNA in G1 te overwinnen, hebben we RPA2 gebruikt, dat zowel de specificiteit als de intensiteit van ssDNA-focidetectie verbetert35. Om nauwkeurige celsynchronisatie te bereiken, gebruikten we RPE1-cellen die efficiënt kunnen worden uitgehongerd en gesynchroniseerd in de G0-fase. Ze kunnen dan worden geïnduceerd om opnieuw in de celcyclus te komen door de toevoeging van serum na serumdeprivatie. Om de synchronisatie-efficiëntie te bevestigen, hebben we de cellen gelabeld met EdU en hun DNA-inhoud met propidiumjodide. We verzamelden verder kwalitatieve en kwantitatieve resultaten via flowcytometrie (aanvullende figuur S1A). De dot-plots laten zien dat na 72 uur serumuithongering ~98% van de cellen zich in de G0-fase bevindt. Na toevoeging van serumbevattende media gedurende 6 uur, komen cellen terug in de celcyclus (zoals te zien is aan de toename van p27-niveaus in figuur 1A), met ~97% van de cellen in G1, terwijl ze slechts <1% cellen hebben in de S-fase, <2% cellen in de G2-fase (aanvullende figuur S1A). Na 20-28 uur toevoeging van serum aan de cellen, gaan ze geleidelijk door de S-fase, zoals blijkt uit de flowcytometriegrafieken (aanvullende figuur S1A). Dit celsynchronisatieprotocol geeft een ~97% zuivere G1-populatie (6 uur na toevoeging van het serum na 72 uur serumuithongering). Om de synchronisatie-efficiëntie verder te valideren, vergeleken we de expressie van celcyclusmarkers na serumafgifte met behulp van western blotting (Figuur 1A en aanvullende figuur S1B) en voerden we tegelijkertijd een EdU-incorporatietest uit om DNA-replicatie te visualiseren. De EdU-kleuring benadrukt ook de synchronisatie-efficiëntie en het gebrek aan DNA-replicatie in de G1-fase (Figuur 1B,C). Conventionele methoden om ssDNA in zoogdiercellen te detecteren, zijn afhankelijk van de detectie van BrdU in ssDNA. Figuur 2A laat zien dat bij behandeling met H2O2 en neocarzinostatine (NCS) de BrdU-foci alleen detecteerbaar waren in cellen in de S-fase, terwijl er geen ssDNA-foci detecteerbaar waren in cellen die niet in de S-fase waren. De BrdU-antilichaamkleuring vertoonde ook een merkbare nucleolaire achtergrondkleuring die in alle kernen kon worden gedetecteerd, onafhankelijk van het stadium van de celcyclus of de toegepaste behandelingen. Met behulp van het hier beschreven EdU-klikprotocol konden we geen co-lokaliserende EdU- en BrdU-foci detecteren, wat duidelijk is in de onbehandelde monsters van Figuur 2A. Om elk BrdU-signaal dat voortkwam uit kruisreactiviteit volledig uit te sluiten, vermeden we EdU-labeling en gebruikten we in plaats daarvan cycline A2 als S-G2-marker. Cycline A2-kleuring liet echter geen CSK-pre-extractie toe, en onder deze omstandigheden zagen we geen BrdU-foci, zelfs niet na genotoxische stress (aanvullende figuur S2A). Dit benadrukt het feit dat CSK-pre-extractie noodzakelijk is voor anti-BrdU-gebaseerde ssDNA-kleuring. Ter controle hebben we de kleuring van BrdU-antilichamen onder denaturerende omstandigheden getest. Dit opent het DNA om de geïncorporeerde BrdU bloot te leggen, waaruit blijkt dat BrdU uniform was geïncorporeerd (aanvullende figuur S2B). RPA2-kleuring daarentegen vertoont NCS- en H2O2-afhankelijke foci-vorming, niet alleen in de S-fase, maar ook in andere celcyclusfasen (Figuur 2B). Ter controle behandelden we de cellen ook met HU, wat alleen ssDNA-accumulatie veroorzaakt in cellen die replicatie ondergaan. Zoals verwacht detecteerden we alleen een signaaltoename bij HU-behandeling met het RPA2-antilichaam in EdU-positieve cellen, wat de specificiteit van deze aanpak benadrukt. Het RPA2-antilichaam kan ook natuurlijk voorkomende ssDNA-vorming detecteren tijdens replicatie in afwezigheid van exogene genotoxische stress (Figuur 2B). De zeer gevoelige aard van het RPA2-antilichaam heeft ons ertoe aangezet om te proberen het te gebruiken in de G1-fase, waar conventionele BrdU-kleuring geen enkel signaal bij genotoxische stress kon detecteren (aanvullende figuur S2C). Figuur 3A laat zien dat de vorming van ssDNA-foci bij behandeling met H2O2 detecteerbaar was bij gebruik van een anti-RPA2-antilichaam, zelfs in G1. Er was een significante toename van het aantal RPA2-foci in deze kernen na behandeling met H2O2 (Figuur 3B). Deze brandpunten waren specifiek voor RPA2, aangezien het uitschakelen van RPA2 het IF-signaal ophief (Figuur 3A,B). Figuur 3C en aanvullende figuur S1C tonen de efficiëntie van RPA2 silencing in deze cellen. In vergelijking met conventionele methoden is op RPA2 gebaseerde detectie van ssDNA zeer gevoelig en kan de toepassing ervan daarom worden uitgebreid naar G1-fasecellen. Figuur 1: Synchronisatie-efficiëntie van RPE1-cellen na serumuithongering. (A) Immunoblots tonen aangegeven eiwitniveaus in asynchrone, G1- en S-fasegesynchroniseerde RPE1-cellen. (B) Representatieve afbeeldingen tonen asynchrone, G1- en S-fasegesynchroniseerde RPE1-cellen die gedurende 30 minuten vóór fixatie werden blootgesteld aan 10 μM EdU en gevisualiseerd door Click-IT-reactie. DAPI werd gebruikt om nucleair DNA tegen te gaan. Schaalbalken = 50 μm. (C) Grafiek toont het percentage EdU-positieve cellen ten opzichte van de totale celpopulatie beoordeeld door DAPI. De foutbalk vertegenwoordigt de standaardfout van het gemiddelde, en de geanalyseerde aantallen kernen waren de volgende: AS n = 219, G1 n = 630, S n = 437. Afkortingen: RPE1 = hTERT-onsterfelijke retinale pigmentepitheelcellen; AS = asynchroon; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: ssDNA-detectie met BrdU-antilichaam of RPA2-antilichaam bij DNA-schade. (A) Representatieve afbeeldingen illustreren ssDNA-foci met behulp van αBrdU (groen), S-fasecellen worden gemarkeerd door EdU (paars) en DAPI werd gebruikt om nucleair DNA tegen te gaan (blauw). RPE1-cellen werden gedurende 48 uur in 10 μM BrdU bewaard voorafgaand aan een aanvullende behandeling. Na 48 uur werden de cellen gedurende 30 minuten gepulseerd met 10 μM EdU, gevolgd door behandeling met H2O2 (250 μM) gedurende 1 uur of Neocarzinostatine (0,5 μg/ml) gedurende 4 uur. Cellen werden gefixeerd na CSK-pre-extractie. Een witte stippellijn geeft de grens van elke kern aan. Schaalbalk = 5 μm. Panelen aan de rechterkant zijn uitvergrote afbeeldingen van de aangegeven S-fase of niet-S-fase kernen. (B) Representatieve afbeeldingen illustreren ssDNA-foci met behulp van αRPA2-antilichamen (groen). Cellen in de S-fase worden gemarkeerd door EdU (paars) en DAPI werd gebruikt om nucleair DNA tegen te gaan (blauw). RPE1-cellen werden gedurende 30 minuten gepulseerd met 10 μM EdU, gevolgd door ofwel 1 uur H2O2 (250 μM), 4 uur Hydroxyurea (2 mM) of 4 uur NCS (0,5 μg/ml). Cellen werden gefixeerd na CSK-pre-extractie. Een witte stippellijn geeft de grens van elke kern aan. Schaalbalk = 10 μm. Panelen aan de rechterkant zijn uitvergrote afbeeldingen van de aangegeven S-fase of niet-S-fase kernen. Afkortingen: ssDNA = enkelstrengs DNA; BrdU = 5-broom-2′-deoxyuridine; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinderol; RPE1 = hTERT-onsterfelijke retinale pigmentepitheelcellen; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; NCS = Neocarzinostatine; HU = hydroxyureum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Detectie van ssDNA-foci in de G1-fase met behulp van RPA2-antilichaam. (A) RPE1-cellen werden getransfecteerd met siRNA’s gericht op RPA2 of een niet-gerichte siRNA-controle, en vervolgens gesynchroniseerd in G1 en pulsgelabeld met 10 μM EdU gedurende 30 minuten voordat ze werden behandeld met H2O2 (250 μM) gedurende 1 uur waar geïndiceerd. DAPI werd gebruikt om nucleair DNA tegen te gaan. Cellen werden gefixeerd na CSK-pre-extractie. Een witte stippellijn geeft de grens van elke kern aan. Schaalbalk = 5 μm. (B) De metingen voor het aantal RPA2-brandpunten/-kernen werden uitgevoerd op basis van twee onafhankelijke experimenten. Tijdens de analyse werden alleen EdU-negatieve cellen in aanmerking genomen. Lijnen geven de gemiddelde waarde op de percelen weer. Voor statistische analyse werd een niet-parametrische ANOVA-test (Kruskal-Wallis) uitgevoerd. De sterren geven P < 0,0001 aan. Het geanalyseerde aantal kernen was als volgt: siNT no H2O2 n = 513, siNT H2O2 n = 603, siRPA2 no H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536. (C) De efficiëntie van de siRNA-knockdown wordt aangetoond in de immunoblotting. Afkortingen: siNT = non-targeting siRNA control; BrdU = 5-broom-2′-deoxyuridine; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinderol; RPE1 = hTERT-onsterfelijke retinale pigmentepitheelcellen; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Kwantificering van ssDNA-foci met behulp van Fiji. Gedetailleerde stappen in Fiji die laten zien hoe RPA2-foci-aantallen in de kern kunnen worden beoordeeld. (A-E) Het maken van een nucleair masker met behulp van het DAPI-kanaal. (F-H) Drempelwaarde om individuele nucleaire ssDNA-foci te identificeren aan de hand van het achtergrondsignaal. Afkortingen: ssDNA = enkelstrengs DNA; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Cytoskeletale (CSK) buffer PIJPEN pH 7.0 10 mM NaCl 100 mM EDTA pH 8 1 mM MgCl2  3 mM D-sucrose 300 mM Triton X-100 0.20% Cocktail van fosfataseremmers 1 tablet per 10 ml Proteaseremmer cocktail 1 tablet per 10 ml verdund in ddH2O n.v.t Buffer voor wassen Triton X-100 0.05% verdund in PBS n.v.t Permeabilisatiebuffer Triton X-100 0.50% verdund in PBS n.v.t Fixatie oplossing Paraformaldehyde 3.60% Triton X-100 0.05% verdund in PBS n.v.t Buffer blokkeren Runderserumalbumine (BSA) 5% Triton X-100 0.10% verdund in PBS n.v.t Click-iT Plus reactie cocktail 1x Click-iT reactiebuffer 435 ml Alexa Fluor PCA-oplossing 5 ml CuSO4-koper beschermer premix 10 ml 1x Click-iT buffer additief 50 ml Totaal volume 500 ml Tabel 1: Samenstelling van de buffers die in dit protocol worden gebruikt. Aanvullende figuur S1. (A) RPE1-cellen werden gesynchroniseerd met de G0-fase met behulp van serumuithongering gedurende 72 uur en vervolgens vrijgegeven in verschillende celcyclusfasen door serum opnieuw te introduceren. Puntplots tonen cellen in G0/G1-, S- of G2/M-fasen, waarbij uren de tijd aangeven na de hernieuwde toevoeging van serum na serumuithongering. De grafiek aan de rechterkant toont het percentage G0/G1-, S- en G2/M-cellen in elke voorwaarde. FACS-analyse werd uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare celproliferatiekit met EdU en propidiumjodide volgens de aanbevelingen van de fabrikant. (B) Niet-bijgesneden western blot-scans voor figuur 1. Getallen tonen molecuulgewichtmarkers in kDa. PARP1 werd gebruikt als belastingscontrole en geladen op de gel die ook werd ontwikkeld tegen CCNA2, p27 (verder gestript voor PCNA) en pH3 (S10) (verder gestript voor H3) door het membraan in stukken te snijden. CCNB1 en RPA2 werden op een aparte gel geladen, waarbij dezelfde hoeveelheid eiwitlysaat werd gebruikt om de vergelijkbaarheid te garanderen. (C) Niet-bijgesneden western blot-scans voor figuur 3. Getallen tonen molecuulgewichtmarkers in kDa. Afkorting: EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende figuur S2: (A) Representatieve afbeeldingen illustreren ssDNA-foci met behulp van BrdU-antilichamen (groen); Cellen in de S-fase worden gemarkeerd door cycline A2 (rood); en DAPI werd gebruikt om nucleair DNA tegen te gaan (blauw). RPE1-cellen werden gedurende 48 uur in 10 μM BrdU bewaard voorafgaand aan verdere behandeling. Na 48 uur werden de cellen behandeld met H2O2 (250 μM) gedurende 1 uur of Neocarzinostatine (0,5 μg/ml) gedurende 4 uur vóór fixatie. Een witte stippellijn geeft de grens van elke kern aan. Schaalbalk = 5 μm. (B) BrdU-kleuring van RPE1-cellen met en zonder denatureringsconditie. Asynchrone RPE1-cellen werden gedurende 48 uur voorbehandeld met 10 μM BrdU. Schaalbalk = 10 μm. (C) De metingen voor het aantal BrdU-foci/-kern werden uitgevoerd op basis van twee onafhankelijke experimenten in G1-gesynchroniseerde RPE1-cellen. Tijdens de analyse werden alleen EdU-negatieve cellen in aanmerking genomen. Lijnen geven de gemiddelde waarde op de percelen weer. Voor statistische analyse werd een niet-parametrische ANOVA-test (Kruskal-Wallis) uitgevoerd. De ‘ns’ geeft aan dat er geen significant verschil is. Het geanalyseerde aantal kernen was als volgt: NT n = 52, NCS n = 105, H2O2 n = 82. Afkortingen: siNT = non-targeting siRNA control; BrdU = 5-broom-2′-deoxyuridine; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylinderol; RPE1 = hTERT-onsterfelijke retinale pigmentepitheelcellen; NCS = Neocarzinostatine. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullende video S1: Schermopname van op Fiji gebaseerde RPA2-foci-analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het handhaven van een gezonde, mycoplasmavrije celkweek is van cruciaal belang voor alle hierboven beschreven experimenten. RPE1-cellen hebben een sterke hechting aan met weefselkweek behandeld plasticware onder normale kweekmedia; Hun bindingseigenschappen nemen echter aanzienlijk af wanneer ze in serumvrije omstandigheden worden bewaard. Om beelden met een hoge resolutie van ssDNA-brandpunten onder een microscoop vast te leggen, moeten de cellen bovendien worden geplateerd op een 0,17 mm dik dekglas, dat niet hydrofiel genoeg is om een goede hechting van RPE1-cellen te ondersteunen. Zonder goed afgeplatte en gelijkmatig verdeelde cellen is het een grote uitdaging om individuele ssDNA-brandpunten te visualiseren. Daarom is het van cruciaal belang om het juiste coatingmateriaal te kiezen (bijv. vitronectine) en voldoende tijd (6-12 uur) te laten voor de cellen om zich te verspreiden en te hechten nadat ze in de G1-fase zijn vrijgegeven.

Een uitdagend onderdeel van het protocol is het verkrijgen van homogene G1-gesynchroniseerde RPE1-cellen. Dit vereist twee cruciale stappen. Ten eerste, voor efficiënte serumuithongering, moeten de cellen worden getrypsiniseerd, grondig gewassen met PBS en direct op nieuwe weefselkweekschalen worden gezaaid met behulp van serumvrije media. Het rechtstreeks wassen van de cellen in weefselkweekschalen om het serum te verwijderen, levert geen efficiënte G0-synchronisatie op. Ten tweede, bij het vrijgeven van cellen in de G1-fase, moeten de cellen opnieuw worden getrypsiniseerd en op verse weefselkweekplaten worden gezaaid. Evenzo zal alleen het veranderen van het medium en het toevoegen van serumbevattend kweekmedium aan de cellen niet resulteren in een synchrone G1-invoer. Bovendien moet de zaaidichtheid van de cellen op de gecoate afdekglazen voor een goede G1-invoer op bepaalde confluentieniveaus liggen. Hoewel perfecte celsynchronisatie over het algemeen niet haalbaar is, geeft dit synchronisatieprotocol dat hier wordt beschreven een ~97% zuivere G1-populatie. De aanbevolen zaaidichtheid voor RPE1 op een dekglaasje met een diameter van 12 mm is ~4 × 104 om een homogeen gezichtsveld voor beeldvorming te verkrijgen, met ongeveer 70% samenvloeiing. Een hogere seeding-dichtheid zorgt ervoor dat cellen loskomen en “afpellen” na CSK-extractie en zal resulteren in een hoger achtergrondsignaal tijdens beeldacquisitie.

Om elk achtergrondsignaal te verminderen en een gunstige signaal-ruisverhouding te bereiken, is grondig wassen na de incubatie van primaire en secundaire antilichamen essentieel. Aangezien er meerdere wasstappen moeten worden toegepast, is het ook essentieel om te voorkomen dat de put tijdens elke wasstap uitdroogt. We minimaliseren dit artefact door minimaal 0,05% Triton X-100 toe te passen in alle was- en incubatiestappen. Zodra de putten waren opgedroogd, vertoonden de cellen een veranderde signaal-ruisverhouding; Dit leidt tot een mozaïekachtig patroon onder de microscoop en kan de evaluatie verstoren. Z-stack-beeldacquisitie in combinatie met deconvolutie kan helpen bij het vastleggen van brandpunten in verschillende brandpuntsvlakken om de analyse te verbeteren.

Conventionele methoden zijn gebaseerd op de detectie van opgenomen BrdU onder niet-denaturerende omstandigheden. Deze methoden zijn echter afhankelijk van de voorbehandeling van de cellen met hoge doseringen BrdU gedurende ten minste 1-2 dagen (of een tijd die overeenkomt met een volledige celcyclus in de gebruikte cellijn) om een uniforme genomische opname te garanderen. Het is onwenselijk dat uitgebreide BrdU-incorporatie interferentie van de celcyclus kan veroorzaken36. Om deze beperkingen aan te pakken, maakt deze methode gebruik van endogene RPA2 om ssDNA-foci te detecteren. Deze aanpak vereist geen replicatiegestuurde BrdU-incorporatie, maar kan ook worden gebruikt in post-mitotische cellen. Aangezien uitgebreide BrdU-integratie niet nodig is, bespaart dit tijd en vermindert het de experimentele complexiteit. Door RPA2-kleuring te gebruiken om ssDNA te visualiseren, kunnen we 2′-deoxy-5-ethynyluridine (EdU) en klikchemie gebruiken om DNA-replicatie te markeren, terwijl mogelijke kruisreactiviteit van de BrdU-antilichamen tegen EdU 27,37,38 wordt vermeden. Er moet speciaal op worden gelet dat de opgenomen EdU tijdens de klikreactie goed wordt gemaskeerd, zodat de BrdU-antilichamen geen kruisreactie krijgen met EdU27,39.

Ten slotte is een belangrijk voordeel van het gebruik van RPA2 in plaats van BrdU simpelweg een superieure signaal-ruisverhouding in vergelijking met BrdU-kleuring buiten de S-fase. We ontdekten dat de niet-denaturerende BrdU-kleuring en het vermogen om ssDNA te visualiseren beperkt is tot de S-fase, zelfs in replicerende cellen (Figuur 2). BrdU-antilichaam bindt alleen aan het voldoende blootgestelde BrdU in ssDNA-rekken. De binding van reparatie-eiwitten, waaronder RPA2, aan de ssDNA-rekken kan de voldoende blootstelling van BrdU in ssDNA onderdrukken of belemmeren. We ontdekten ook dat CSK-pre-extractie nodig is voor ssDNA-visualisatie met behulp van BrdU-antilichaam. Dit is mogelijk omdat de ssDNA-sporen niet toegankelijk zijn voor het antilichaam zonder er licht gebonden eiwitcomponenten uit te verwijderen.

Desalniettemin zijn er enkele beperkingen verbonden aan dit protocol. Een beperking van het gebruik van RPA2 voor ssDNA-detectie is de noodzaak om de CSK-pre-extractiestap te optimaliseren. Ongebonden, overtollig RPA2 moet uit het DNA worden weggespoeld voordat de cellen worden gefixeerd. Aan de ene kant leidt onderextractie tot een hoge achtergrond door de RPA2-eiwitfractie die niet gebonden is aan ssDNA. Aan de andere kant zal overextractie leiden tot signaalverlies. Voor BrdU-detectie is dit geen variabele, omdat BrdU stabiel in het DNA is opgenomen en niet kan worden weggespoeld door pre-extractie. Daarom moet zorgvuldig rekening worden gehouden met het tijdstip van de CSK-pre-extractie, de hoeveelheid Triton X-100 in de buffer, het volume en de temperatuur waarbij de pre-extractie wordt uitgevoerd. CSK-pre-extractie beperkt ook het gebruik van de kerngrootte om G0/G1-cellen te onderscheiden van S/G2-cellen.

Bovendien kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat een deel van het signaal dat afkomstig is van RPA2 afkomstig is van het feit dat het gebonden is aan andere chromatine-bindende eiwitinteractoren. Men moet ook rekening houden met de soortspecificiteit van het RPA2-antilichaam. Het antilichaam dat in dit protocol wordt gebruikt, kan RPA2 van mensen, muizen, ratten, hamsters en apen herkennen. Een andere beperking van deze aanpak is dat niet alle cellijnen serum-uitgehongerd kunnen worden voor G0-synchronisatie. De meeste kankercellijnen kunnen de controlepunten van de celcyclus omzeilen en zich zelfs in serumarme media vermenigvuldigen. Hoewel serumuithongering gunstig is, omdat het geen DNA-schade veroorzaakt, moet men de efficiëntie van hun celsynchronisatie zorgvuldig controleren om ervoor te zorgen dat de juiste verrijking van de celcyclusfase wordt bereikt. Voor cellen die niet reageren op serumdeprivatie, moeten andere celsynchronisatiemethoden worden overwogen (bijv. mitotische shake off, CDK1-remming voor G2-arrestatie of niet-invasieve technieken zoals centrifugale elutriatie). Een andere mogelijke methode is het gebruik van beeldvorming met een hoog gehalte om het EdU- en nucleair DNA-gehalte te meten voor celcyclusprofilering van asynchrone cellen31. Men moet rekening houden met de implicaties van het gebruik van alternatieve synchronisatiemethoden om interferentie met stroomafwaartse analyse te voorkomen. Het gebruik van een dubbel thymidineblok of aphidicolin, dat vaak in de literatuur wordt gebruikt, zal bijvoorbeeld leiden tot replicatiestress enDNA-schade.

Het onderzoek naar DNA-reparatiemechanismen blijft een centraal punt van discussie op het gebied van kanker en celbiologie. Het hier gepresenteerde protocol biedt een waardevolle benadering voor de voorbereiding van cellen, waardoor de visualisatie en kwantitatieve analyse van ssDNA bij blootstelling aan DNA-beschadigende stoffen mogelijk wordt. Dit protocol benadrukt met name het gebruik van het ssDNA-bindende eiwit, RPA2, wat de hoge specificiteit ervan aantoont om kleine hoeveelheden ssDNA-foci te visualiseren en tegelijkertijd ongewenste kruisreactiviteit in alle fasen van de celcyclus te vermijden. Het gebruik van RPA2 biedt tal van voordelen, met name voor onderzoekers die cellen in de G1-fase van de celcyclus willen analyseren. Dit protocol houdt rekening met verschillende beperkingen en lost problemen op met betrekking tot signaalinterferentie, ongewenste achtergrondruis en kruisreactiviteit bij het gebruik van RPA2- of BrdU-kleuring om ssDNA te detecteren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Michele Pagano voor zijn steun en nuttige inzichten, Ashley Chui en Sharon Kaisari voor het kritisch lezen van het manuscript, en Jeffrey Estrada en Vilma Diaz voor hun voortdurende steun. Dit werk werd ondersteund door een diversiteitssupplement op de National Institutes of Health-subsidie GM136250.

Materials

Alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T6074 primary antibody (1:5,000)
Axio Observer Inverted Microscope Zeiss na microscope
Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% Invitrogen  NW04127BOX Western Blot
Bovine Serum Albumin  Jackson ImmunoResearch  001-000-162 blocking
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine)  Sigma-Aldrich B5002-100MG nucleotide analogue
BrdU antibody BU1/75 Abcam ab6326 primary antibody (1:500)
CellAdhere Dilution Buffer Stemcell Technologies 07183 coating reagent
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits  Invitrogen  C10632 flow cytomery 
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye Thermo Fisher Scientific C10640 click-reaction kit
cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich 5892791001 reagent
Countess 3 Automated cell counter  Thermo Scientific AMQAX2000 cell counter
Coverslip  neuVitro GG12PRE tissue culture
Cyclin A2 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-271682 primary antibody (1:1,000) for IF and WB
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-245 primary antibody (1:5,000)
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML vehicle control
DMEM, high glucose, with HEPES Gibco 12430051 cell culture medium for RPE cells
DPBS, no calcium, no magnesium  Gibco 14190144 the PBS used throughout the protocol
D-Sucrose Thermo Fisher Scientific bp220-1 reagent
Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope  Nikon na microscope
EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)  Thermo Fisher Scientific C10637 nucleotide analog
Falcon 24-well plate Corning  351147 tissue culture
Falcon Cell Culture Dishes 100 mm Corning  353003 tissue culture
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 16140071 media supplement
Fiji (ImageJ) NIH version 1.54f software and algorithms
FxCycle PI/RNase Staining Solution Invitrogen  F10797 PI staining
Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Thermo Fisher Scientific A21422 secondary antibody (1:1,000)
Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Thermo Fisher Scientific A48262 secondary antibody (1:1,000)
Histone H3 antibody Abcam ab1791 primary antibody (1:10,000)
hTERT RPE1 ATCC CRL-3216 cell line
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758-100ML reagent
Hydrogen peroxide 30% soultion Sigma-Aldrich H1009-100ML reagent
Hydroxyurea,98% powder Sigma-Aldrich H8627-5G reagent
Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15-575-020 reagent
Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent Invitrogen  13778150 transfection reagent
Magnesium chloride solution 1 M Sigma-Aldrich M1028-100ML reagent
MycoFluor Thermo Fisher M7006 Mycoplasma Detection Kit
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus  Sigma-Aldrich N9162-100UG reagent
NuPage MES SDS Running Buffer (20x) Invitrogen  NP0002 Western Blot
onTARGETplus Human RPA2 siRNA Dharmacon L-017058-01-0005 siRNA
p27 antibody BD Biosciences  610241 primary antibody (1:1,000)
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) Electron Microscopy Sciences 50-980-494 fixative
PARP1 antibody Cell Signaling Technology  9542S primary antibody (1:1,000)
PCNA antibody Cell Signaling Technology  13110S primary antibody (1:2,000)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140163 media supplement
pH3 antibody Cell Signaling Technology 3377S primary antibody (1:2,000)
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets Sigma-Aldrich 4906837001 reagent
PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 Bioworld 41620034-1 reagent
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards Bio-Rad 1610395 Western Blot
Prism GraphPad version 10 statistical analysis and graph
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Scientific P36961 mounting media
Reduced serum media (Opti-MEM) Gibco 31985070 used for transfection
Rpa32/rpa2 antibody (mouse) EMD Millipore NA19L primary antibody (1:1,000) for WB
Rpa32/rpa2 antibody (rat) Cell Signaling Technology  2208S primary antibody (1:1,000) for IF
Sodium Chloride solution (5 M) Sigma-Aldrich S5150 reagent
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 media supplement
Sodium tetraborate decahydrate Sigma-Aldrich B3535-500G reagent
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain  Thermo Scientific 62248 nucleic acid stain
Thymidine,powder Sigma-Aldrich T1985-1G reagent
Triton X-100 aqueous solution (10%) Sigma-Aldrich 11332481001 detergent
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 1540054 cell dissociation agent
Vitronectin XF Stemcell Technologies 07180 coating reagent
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad na flow cytomery 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and ugly. EMBO J. 27 (4), 589-605 (2008).
  2. Gutierrez, R., O’Connor, T. R. DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance. Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).
  3. Krokan, H. E., Bjoras, M. Base excision repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583 (2013).
  4. Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).
  5. Li, G. M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 18 (1), 85-98 (2008).
  6. Hustedt, N., Durocher, D. The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol. 19 (1), 1-9 (2016).
  7. Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  8. Bhat, D. S., et al. Therapeutic disruption of RAD52-ssDNA complexation via novel drug-like inhibitors. NAR Cancer. 5 (2), zcad018 (2023).
  9. Gupta, P., Saha, B., Chattopadhyay, S., Patro, B. S. Pharmacological targeting of differential DNA repair, radio-sensitizes WRN-deficient cancer cells in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 186, 114450 (2021).
  10. Pena-Diaz, J., et al. Noncanonical mismatch repair as a source of genomic instability in human cells. Mol Cell. 47 (5), 669-680 (2012).
  11. Schroering, A. G., Edelbrock, M. A., Richards, T. J., Williams, K. J. The cell cycle and DNA mismatch repair. Exp Cell Res. 313 (2), 292-304 (2007).
  12. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
  13. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  14. Genschel, J., Modrich, P. Mechanism of 5′-directed excision in human mismatch repair. Mol Cell. 12 (5), 1077-1086 (2003).
  15. Hu, J., et al. Nucleotide excision repair in human cells: fate of the excised oligonucleotide carrying DNA damage in vivo. J Biol Chem. 288 (29), 20918-20926 (2013).
  16. Huertas, P., Jackson, S. P. Human CtIP mediates cell cycle control of DNA end resection and double strand break repair. J Biol Chem. 284 (14), 9558-9565 (2009).
  17. Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in DNA replication with putative roles in cancer. Int J Mol Sci. 20 (1), 74 (2018).
  18. Symington, L. S. End resection at double-strand breaks: mechanism and regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (8), a016436 (2014).
  19. Liu, Y., et al. DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair. J Biol Chem. 280 (5), 3665-3674 (2005).
  20. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  21. Wienholz, F., Vermeulen, W., Marteijn, J. A. Amplification of unscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cell quantification of transcription-coupled nucleotide excision repair. Nucleic Acids Res. 45 (9), e68 (2017).
  22. Wold, M. S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  23. Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: single-stranded DNA’s first responder: dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. Bioessays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
  24. Kang, Y., et al. Alteration of replication protein A binding mode on single-stranded DNA by NSMF potentiates RPA phosphorylation by ATR kinase. Nucleic Acids Res. 51 (15), 7936-7950 (2023).
  25. Kilgas, S., Kiltie, A. E., Ramadan, K. Immunofluorescence microscopy-based detection of ssDNA foci by BrdU in mammalian cells. STAR Protoc. 2 (4), 100978 (2021).
  26. Madabhushi, R., Pan, L., Tsai, L. H. DNA damage and its links to neurodegeneration. Neuron. 83 (2), 266-282 (2014).
  27. Liboska, R., Ligasova, A., Strunin, D., Rosenberg, I., Koberna, K. Most anti-BrdU antibodies react with 2′-deoxy-5-ethynyluridine — the method for the effective suppression of this cross-reactivity. PLoS One. 7 (12), e51679 (2012).
  28. Biehs, R., et al. DNA double-strand break resection occurs during non-homologous end joining in G1 but is distinct from resection during homologous recombination. Mol Cell. 65 (4), 671-684.e5 (2017).
  29. Cruz-Garcia, A., Lopez-Saavedra, A., Huertas, P. BRCA1 accelerates CtIP-mediated DNA-end resection. Cell Rep. 9 (2), 451-459 (2014).
  30. Ercilla, A., et al. Physiological tolerance to ssDNA enables strand uncoupling during DNA replication. Cell Rep. 30 (7), 2416-2429.e7 (2020).
  31. Lezaja, A., et al. RPA shields inherited DNA lesions for post-mitotic DNA synthesis. Nat Commun. 12 (1), 3827 (2021).
  32. Mukherjee, B., Tomimatsu, N., Burma, S. Immunofluorescence-based methods to monitor DNA end resection. Methods Mol Biol. 1292, 67-75 (2015).
  33. Ochs, F., et al. 53BP1 fosters fidelity of homology-directed DNA repair. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 714-721 (2016).
  34. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  35. Forment, J. V., Walker, R. V., Jackson, S. P. A high-throughput, flow cytometry-based method to quantify DNA-end resection in mammalian cells. Cytometry A. 81 (10), 922-928 (2012).
  36. Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Sci Rep. 6, 19567 (2016).
  37. Aten, J. A., Bakker, P. J., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. Histochem J. 24 (5), 251-259 (1992).
  38. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-phase labeling of dividing stem cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
  39. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. Cell proliferation method: click chemistry based on BrdU coupling for multiplex antibody staining. Curr Protoc Cytom. Chapter 7, (2008).
  40. Ligasova, A., Koberna, K. Strengths and weaknesses of cell synchronization protocols based on inhibition of DNA synthesis. Int J Mol Sci. 22 (19), 10759 (2021).

Tags

Single-stranded DNADNA Damage ResponseDNA RepairRPA2Cell CycleG1 PhaseImmunofluorescenceDNA LesionsDNA PolymerasesSsDNA Foci

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Q., Kerzhnerman, M. A., García-Vázquez, N., Rona, G. Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle. J. Vis. Exp. (202), e65926, doi:10.3791/65926 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image