Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde in der G1-Phase des Zellzyklus

Um die Einschränkungen beim Nachweis von ssDNA in G1 zu überwinden, haben wir RPA2 verwendet, das sowohl die Spezifität als auch die Intensität des Nachweises von ssDNA-Foci verbessert35. Um eine präzise Zellsynchronisation zu erreichen, haben wir RPE1-Zellen verwendet, die effizient serumgehungert und in die G0-Phase synchronisiert werden können. Sie können dann durch die Zugabe von Serum nach Serumentzug dazu gebracht werden, wieder in den Zellzyklus einzutreten. Um die Synchronisationseffizienz zu bestätigen, markierten wir die Zellen mit EdU und ihren DNA-Gehalt mit Propidium-Iodid. Des Weiteren wurden qualitative und quantitative Ergebnisse mittels Durchflusszytometrie erhoben (Ergänzende Abbildung S1A). Die Punktdiagramme zeigen, dass sich nach 72 h Serumhunger ~98% der Zellen in der G0-Phase befinden. Nach der Zugabe von serumhaltigen Medien für 6 h treten die Zellen wieder in den Zellzyklus ein (wie durch den Anstieg der p27-Spiegel in Abbildung 1A zu sehen ist), wobei ~97 % der Zellen in G1 vorhanden sind, während sie nur <1 % Zellen in der S-Phase und <2 % Zellen in der G2-Phase aufweisen (ergänzende Abbildung S1A). Nach 20-28 Stunden Zugabe von Serum zu den Zellen durchlaufen sie allmählich die S-Phase, wie die Durchflusszytometrie-Diagramme zeigen (Ergänzende Abbildung S1A). Dieses Zellsynchronisationsprotokoll ergibt eine ~97% reine G1-Population (6 Stunden nach Serumzugabe nach 72 Stunden Serumhunger). Um die Synchronisationseffizienz weiter zu validieren, verglichen wir die Expression von Zellzyklusmarkern nach Serumfreisetzung mit Western Blot (Abbildung 1A und ergänzende Abbildung S1B) und führten parallel dazu einen EdU-Inkorporationsassay durch, um die DNA-Replikation zu visualisieren. Die EdU-Färbung unterstreicht auch die Synchronisationseffizienz und die fehlende DNA-Replikation in der G1-Phase (Abbildung 1B,C). Herkömmliche Methoden zum Nachweis von ssDNA in Säugetierzellen beruhen auf dem Nachweis von BrdU in ssDNA. Abbildung 2A zeigt, dass nach der Behandlung mitH2O2und Neocarzinostatin (NCS) die BrdU-Foci nur in S-Phase-Zellen nachweisbar waren, während in Nicht-S-Phase-Zellen keine ssDNA-Foci nachweisbar waren. Die BrdU-Antikörper-Färbung zeigte auch eine auffällige nukleoläre Hintergrundfärbung, die in allen Zellkernen nachgewiesen werden konnte, unabhängig vom Zellzyklusstadium oder den angewendeten Behandlungen. Mit dem hier beschriebenen EdU-Click-Protokoll konnten wir keine kolokalisierenden EdU- und BrdU-Herde nachweisen, was in den unbehandelten Proben in Abbildung 2A deutlich wird. Um ein BrdU-Signal, das durch Kreuzreaktivität entstanden ist, vollständig auszuschließen, haben wir auf eine EdU-Markierung verzichtet und stattdessen Cyclin A2 als S-G2-Marker verwendet. Die Cyclin-A2-Färbung erlaubte jedoch keine CSK-Vorextraktion, und unter dieser Bedingung sahen wir auch nach genotoxischem Stress keine BrdU-Herde (Ergänzende Abbildung S2A). Dies unterstreicht die Tatsache, dass die CSK-Vorextraktion für die Anti-BrdU-basierte ssDNA-Färbung notwendig ist. Als Kontrolle testeten wir die BrdU-Antikörperfärbung unter denaturierenden Bedingungen. Dadurch wird die DNA geöffnet, um das eingebaute BrdU freizulegen, was zeigt, dass BrdU gleichmäßig eingebaut wurde (Ergänzende Abbildung S2B). Im Gegensatz dazu zeigt die RPA2-Färbung NCS- undH2O2-abhängige Foci-Bildung nicht nur in der S-Phase, sondern auch in anderen Zellzyklusphasen (Abbildung 2B). Als Kontrolle behandelten wir die Zellen auch mit HU, was nur zu einer ssDNA-Akkumulation in Zellen führt, die sich replizieren. Wie erwartet, konnten wir nur in EdU-positiven Zellen einen Signalanstieg nach HU-Behandlung mit dem RPA2-Antikörper feststellen, was die Spezifität dieses Ansatzes unterstreicht. Der RPA2-Antikörper kann auch die natürlich vorkommende ssDNA-Bildung während der Replikation in Abwesenheit von exogenem genotoxischem Stress nachweisen (Abbildung 2B). Die hohe Sensitivität des RPA2-Antikörpers veranlasste uns, ihn in der G1-Phase einzusetzen, in der die konventionelle BrdU-Färbung kein Signal für genotoxischen Stress nachweisen konnte (Ergänzende Abbildung S2C). Abbildung 3A zeigt, dass die Bildung von ssDNA-Foci nachH2O2-Behandlungbei Verwendung eines Anti-RPA2-Antikörpers auch in G1 nachweisbar war. Es gab einen signifikanten Anstieg der Anzahl der RPA2-Herde in diesen Kernen nachH2O2-Behandlung (Abbildung 3B). Diese Foci waren spezifisch für RPA2, da die Stummschaltung von RPA2 das IF-Signal abschaffte (Abbildung 3A,B). Abbildung 3C und ergänzende Abbildung S1C zeigen die Effizienz der RPA2-Stummschaltung in diesen Zellen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ist der RPA2-basierte Nachweis von ssDNA hochsensitiv und kann daher auf G1-Phasenzellen ausgeweitet werden. Abbildung 1: Synchronisationseffizienz von RPE1-Zellen nach Serumhunger . (A) Immunoblots zeigen angezeigte Proteinspiegel in asynchronen, G1- und S-Phasen-synchronisierten RPE1-Zellen. (B) Repräsentative Bilder zeigen asynchrone, G1- und S-Phasen-synchronisierte RPE1-Zellen, die vor der Fixierung 30 Minuten lang bei 10 μM EdU exponiert und durch Click-IT-Reaktion visualisiert wurden. DAPI wurde verwendet, um die Kern-DNA zu entfärben. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Die Grafik zeigt den prozentualen Anteil der EdU-positiven Zellen an der gesamten Zellpopulation, die mit DAPI bewertet wurde. Der Fehlerbalken stellt den Standardfehler des Mittelwerts dar, und die analysierte Anzahl der Kerne war die folgende: AS n = 219, G1 n = 630, S n = 437. Abkürzungen: RPE1 = hTERT-immortalisierte retinale Pigmentepithelzellen; AS = asynchron; EdU = 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: ssDNA-Nachweis mit BrdU-Antikörper oder RPA2-Antikörper bei DNA-Schädigung. (A) Repräsentative Bilder veranschaulichen ssDNA-Foci mit αBrdU (grün), S-Phasenzellen werden durch EdU hervorgehoben (violett) und DAPI wurde verwendet, um nukleäre DNA gegenfärbend zu färben (blau). RPE1-Zellen wurden vor einer weiteren Behandlung 48 Stunden lang in 10 μM BrdU aufbewahrt. Nach 48 h wurden die Zellen mit 10 μM EdU für 30 min gepulst, gefolgt von einer Behandlung mitH2O2(250 μM) für 1 h oder Neocarzinostatin (0,5 μg/ml) für 4 h. Die Zellen wurden nach der CSK-Vorextraktion fixiert. Eine weiß gestrichelte Linie markiert den Rand jedes Kerns. Maßstabsbalken = 5 μm. Die Tafeln auf der rechten Seite zeigen vergrößerte Bilder der angedeuteten S-Phasen- oder Nicht-S-Phasenkerne. (B) Repräsentative Bilder veranschaulichen ssDNA-Herde mit αRPA2-Antikörpern (grün). S-Phase-Zellen werden durch EdU (violett) hervorgehoben, und DAPI wurde verwendet, um die Kern-DNA (blau) zu entfärben. RPE1-Zellen wurden 30 Minuten lang mit 10 μM EdU gepulst, gefolgt von entweder 1 hH2O2(250 μM), 4 h Hydroxyharnstoff (2 mM) oder 4 h NCS (0,5 μg/ml). Die Zellen wurden nach der CSK-Vorextraktion fixiert. Eine weiß gestrichelte Linie markiert den Rand jedes Kerns. Maßstabsleiste = 10 μm. Die Tafeln auf der rechten Seite zeigen vergrößerte Bilder der angedeuteten S-Phasen- oder Nicht-S-Phasenkerne. Abkürzungen: ssDNA = einzelsträngige DNA; BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; RPE1 = hTERT-immortalisierte retinale Pigmentepithelzellen; EdU = 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin; NCS = Neocarzinostatin; HU = Hydroxyharnstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Nachweis von ssDNA-Herden in der G1-Phase mittels RPA2-Antikörper. (A) RPE1-Zellen wurden entweder mit siRNAs, die auf RPA2 abzielen, oder mit einer nicht-zielgerichteten siRNA-Kontrolle transfiziert und anschließend in G1 synchronisiert und 30 min lang mit 10 μM EdU gepulst, bevor sie mit H2O2 (250μM) für 1 h behandelt wurden, wo dies angezeigt war. DAPI wurde verwendet, um die Kern-DNA zu entfärben. Die Zellen wurden nach der CSK-Vorextraktion fixiert. Eine weiß gestrichelte Linie markiert den Rand jedes Kerns. Maßstabsbalken = 5 μm. (B) Die Messungen für die Anzahl der RPA2-Herde/-Kerne wurden in zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Bei der Analyse wurden nur EdU-negative Zellen berücksichtigt. Linien stellen den Mittelwert in den Diagrammen dar. Für die statistische Analyse wurde ein nicht-parametrischer ANOVA-Test (Kruskal-Wallis) durchgeführt. Die Sterne zeigen P < 0,0001 an. Die Anzahl der untersuchten Kerne war wie folgt: siNT noH2O2n= 513, siNT H2 O2 n = 603, siRPA2 no H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536. (C) Die Effizienz des siRNA-Knockdowns zeigt sich im Immunoblotting. Abkürzungen: siNT = non-targeting siRNA control; BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; RPE1 = hTERT-immortalisierte retinale Pigmentepithelzellen; EdU = 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Quantifizierung von ssDNA-Herden anhand von Fidschi. Detaillierte Schritte in Fidschi, die zeigen, wie die Anzahl der RPA2-Foci im Zellkern zu beurteilen ist. (A-E) Die Erstellung einer nuklearen Maske unter Verwendung des DAPI-Kanals. (F-H) Schwellenwerte zur Identifizierung einzelner nukleärer ssDNA-Foci aus dem Hintergrundsignal. Abkürzungen: ssDNA = einzelsträngige DNA; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Zytoskelett-Puffer (CSK) ROHRE pH 7,0 10 mM NaCl 100 mM EDTA pH 8 1 mM MgCl2  3 mM D-Saccharose 300 mM Triton X-100 0.20% Phosphatase-Hemmer-Cocktail 1 Tablette pro 10 ml Protease-Inhibitor-Cocktail 1 Tablette pro 10 ml verdünnt inddH2O n/a Wasch-Puffer Triton X-100 0.05% verdünnt in PBS n/a Permeabilisierungspuffer Triton X-100 0.50% verdünnt in PBS n/a Fixierungslösung Paraformaldehyd 3.60% Triton X-100 0.05% verdünnt in PBS n/a Blockieren des Puffers Rinderserumalbumin (BSA) 5% Triton X-100 0.10% verdünnt in PBS n/a Click-iT Plus Reaktions-Cocktail 1x Click-iT Reaktionspuffer 435 ml Alexa Fluor PCA-Lösung 5 ml CuSO 4-Kupfer-Schutzmittel-Vormischung 10 ml 1x Click-iT Puffer-Additiv 50 ml Gesamtvolumen 500 ml Tabelle 1: Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Puffer. Ergänzende Abbildung S1. (A) RPE1-Zellen wurden mit der G0-Phase synchronisiert, indem sie 72 Stunden lang ausgehungert und anschließend durch erneute Einführung von Serum in verschiedene Zellzyklusphasen freigesetzt wurden. Punktdiagramme zeigen Zellen in G0/G1-, S- oder G2/M-Phasen, wobei Stunden die Zeit nach der erneuten Zugabe von Serum nach Serumhunger angeben. Das Diagramm auf der rechten Seite zeigt den Prozentsatz der G0/G1-, S- und G2/M-Zellen in jeder Bedingung. Die FACS-Analyse wurde mit einem handelsüblichen Zellproliferationskit unter Verwendung von EdU und Propidiumiodid gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. (B) Unbeschnittene Western-Blot-Scans für Abbildung 1. Die Zahlen zeigen Molekulargewichtsmarker in kDa. PARP1 wurde als Beladungskontrolle verwendet und auf das Gel geladen, das auch gegen CCNA2, p27 (für PCNA weiter abgestreift) und pH3 (S10) (weiter abgestreift für H3) entwickelt wurde, indem die Membran zerschnitten wurde. CCNB1 und RPA2 wurden auf ein separates Gel geladen, wobei die gleiche Menge an Proteinlysat verwendet wurde, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten. (C) Unbeschnittene Western-Blot-Scans für Abbildung 3. Die Zahlen zeigen Molekulargewichtsmarker in kDa. Abkürzung: EdU = 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung S2: (A) Repräsentative Bilder veranschaulichen ssDNA-Herde unter Verwendung von BrdU-Antikörpern (grün); Zellen der S-Phase werden durch Cyclin A2 (rot) hervorgehoben; und DAPI wurde verwendet, um Kern-DNA (blau) zu konterkarieren. RPE1-Zellen wurden vor der weiteren Behandlung 48 Stunden lang in 10 μM BrdU aufbewahrt. Nach 48 h wurden die Zellen vor der Fixierung für 1 h mitH2O2(250 μM) oder Neocarzinostatin (0,5 μg/ml) für 4 h behandelt. Eine weiß gestrichelte Linie markiert den Rand jedes Kerns. Skalenbalken = 5 μm. (B) BrdU-Färbung von RPE1-Zellen mit und ohne denaturierende Bedingung. Asynchrone RPE1-Zellen wurden mit 10 μM BrdU für 48 h vorbehandelt. Maßstabsbalken = 10 μm. (C) Die Messungen für die Anzahl der BrdU-Herde/-Kerne wurden aus zwei unabhängigen Experimenten in G1-synchronisierten RPE1-Zellen durchgeführt. Bei der Analyse wurden nur EdU-negative Zellen berücksichtigt. Linien stellen den Mittelwert in den Diagrammen dar. Für die statistische Analyse wurde ein nicht-parametrischer ANOVA-Test (Kruskal-Wallis) durchgeführt. Das “ns” steht für einen nicht signifikanten Unterschied. Die Anzahl der untersuchten Kerne war wie folgt: NT n = 52, NCS n = 105, H2O2 n = 82. Abkürzungen: siNT = non-targeting siRNA control; BrdU = 5-Brom-2′-desoxyuridin; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; RPE1 = hTERT-immortalisierte retinale Pigmentepithelzellen; NCS = Neocarzinostatin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzendes Video S1: Bildschirmaufzeichnung der RPA2-Fokusanalyse auf den Fidschi-Inseln. 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