הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא
Summary
הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.
Abstract
לדנ”א מסלולי תיקון תאיים ייעודיים המסוגלים להתמודד עם נגעים שעלולים לנבוע הן ממקורות אנדוגניים והן ממקורות אקסוגניים. תיקון DNA דורש שיתוף פעולה בין חלבונים רבים, האחראים לכסות מגוון רחב של משימות, החל מזיהוי ואיתות על נוכחות נגע DNA ועד לתיקון פיזי שלו. במהלך תהליך זה, עקבות של DNA חד-גדילי (ssDNA) נוצרים לעתים קרובות, אשר בסופו של דבר מתמלאים על ידי DNA פולימראזות. טבען של רצועות ssDNA אלה (הן מבחינת אורך והן מבחינת מספר), יחד עם הפולימראז שגויס כדי למלא פערים אלה, הם ספציפיים למסלול תיקון. ההדמיה של מסלולי ssDNA אלה יכולה לעזור לנו להבין את הדינמיקה המסובכת של מנגנוני תיקון דנ”א.
פרוטוקול זה מספק שיטה מפורטת להכנת תאים מסונכרנים G1 למדידת היווצרות מוקדי ssDNA בעת לחץ גנוטוקסי. באמצעות גישה אימונופלואורסצנטית קלה לניצול, אנו מדמיינים ssDNA על ידי צביעה עבור RPA2, מרכיב של חלבון השכפול ההטרוטרימרי קומפלקס A (RPA). RPA2 נקשר ומייצב מתווכי ssDNA המתעוררים בעקבות לחץ גנוטוקסי או שכפול כדי לשלוט בתיקון הדנ”א ובהפעלת מחסום הנזק לדנ”א. צביעת 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) משמשת להדמיה של שכפול DNA כדי לא לכלול תאים בשלב S. פרוטוקול זה מספק גישה חלופית לבדיקות הקונבנציונליות המבוססות על 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) והוא מתאים יותר לזיהוי מוקדי ssDNA מחוץ לשלב S.
Introduction
כדי לקיים חיים, תאים סוקרים ומתקנים דנ”א ללא הרף כדי לשמור על שלמותם הגנומית. תאים עלולים לצבור סוגים שונים של נזק לדנ”א עקב מקורות אנדוגניים (למשל, חמצון, אלקילציה, דהמינציה, שגיאות שכפול) ואקסוגניים (למשל, UV, קרינה מייננת) של גורמי עקה של DNA. כישלון לתקן נגעים אלה גורם אפופטוזיס, מעצר מחזור התא, או הזדקנות יכול להוביל למחלות1. נגעי DNA יכולים להיות מטופלים על ידי כל אחד ממסלולי תיקון ה- DNA העיקריים הבאים: DR (תיקון היפוך ישיר), אשר מתקן בעיקר בסיסים אלקילטים2; BER (תיקון כריתת בסיס), המכוון לשגיאות בסיסי DNA לא מגושמים ולשברי DNA חד-גדיליים (SSB)3; NER (תיקון כריתת נוקלאוטידים) תיקון נגעי DNA מגושמים ומעוותים סליל4; MMR (תיקון אי-התאמה) מתמקד בעיקר באי-התאמות DNA, לולאות החדרה/מחיקה (IDLs) ונזקי בסיס מסוימים5; NHEJ (חיבור קצה לא הומולוגי) ו- HRR (תיקון רקומבינציה הומולוגית) הפעילים שניהם בהפסקות DNA דו-גדיליות (DSBs)6; ו-TLS (translesion synthesis), שהוא מנגנון מעקף נגע DNA7. למרות שלמסלולים אלה יש ייחודיות מצע ברורה, יש ביניהם חפיפות מסוימות כדי להבטיח יתירות לתיקון יעיל. הבנת הפעולה של מסלולי תיקון הדנ”א השונים בשלבים שונים של מחזור התא היא חיונית מכיוון שגורמי תיקון דנ”א אלה יכולים לשמש מטרות חיוניות לגישות טיפוליות לטיפול בסרטן, הזדקנות והפרעות נוירולוגיות 8,9.
DNA חד-גדילי (ssDNA) נוצר לאורך מחזור התא עקב תיקון נגעי DNA שנוצרו על ידי גורמים אנדוגניים ואקסוגניים הפוגעים ב- DNA. בעקה גנוטוקסית, ssDNA נוצר בשפע בשלבי S ו-G2 שבהם HRR ו-MMR הם בעלי הפעילות הגבוהה ביותר שלהם וכאשר מנגנון השכפול נתקע או קורס כאשר הם נתקלים בנגעי DNA 6,10,11. מסלולי תיקון דנ”א אחרים (למשל, NHEJ/microhomology-mediated end joining (MMEJ)/Single strand annealing [SSA]) מייצרים גם הם ssDNA במהלך תיקון DSB12. עקבות ssDNA אלה נובעות בדרך כלל מכריתת DNA, המבוצעת על ידי אקסונוקלאזות כגון EXO1, DNA2 ו- CtIP במהלך HR ו- MMR, אנדונוקלאזות כגון XPF ו- XPG במהלך NER, או באמצעות הפעולה המשולבת של POLB ו- FEN1 במהלך BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . הודות לעבודת מנגנון השכפול, עקבות ssDNA נוצרות גם כאשר מנחת המסוקים של הדנ”א משחרר את הדנ”א מול פולימראזות משוכפלות הקשורות ל-PCNA20. לעומת זאת, בשלב G1, היעדר HRR ושכפול DNA והפעילות המוגבלת של MMR מפחיתים את היקף עקבות ssDNA הנוצרים ולכן מאתגרים יותר לאיתור 10,11,21.
רצועות ssDNA תאיות הן מבנים רגישים מאוד שיש להגן עליהם כדי למנוע היווצרות DSB. זה מושג על ידי ציפוי עקבות ssDNA עם RPA. RPA הוא קומפלקס חלבונים הטרוטרימרי שופע המורכב מתת-יחידות מרובות (RPA1, RPA2 ו-RPA3, המכונים גם RPA70, RPA32 ו-RPA14, בהתאמה), אשר באים לידי ביטוי בכל מקום לאורך מחזורהתא 22. כל תת-יחידה של RPA מכילה תחום קושר DNA (DBD), המסוגל לקיים אינטראקציה עם 4-6 נוקלאוטידים, ותת-היחידות המשולבות יוצרות ליבת טרימריזציה יציבה. בסך הכל, RPA נקשר לכ-20-30 נוקלאוטידים בעלי זיקה תת-ננומולרית23,24.
שיטות קונבנציונליות משתמשות במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי (IF) כדי להמחיש מוקדי ssDNA על ידי תיוג 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) המשולב בדנ”א גנומי באמצעות נוגדני BrdU25. גישה זו מסתמכת על העובדה כי נוגדני BrdU יכולים לזהות BrdU רק ב- ssDNA25 חשוף. למרות שגישה זו פשוטה, היא מציגה גם מגבלות מסוימות. לדוגמה, תאים מטופלים מראש כדי לשלב BrdU לפני תחילת הניסוי, וזה לוקח זמן רב ויכול להפריע למשפיעים במורד הזרם. לכן, זיהוי ssDNA מבוסס BrdU מוגבל לתאים משוכפלים ולא ניתן להשתמש בו עבור תאים שקטים. זה לא כולל את היישום של שיטה זו כדי לחקור תיקון DNA בתאים שאינם משתכפלים למרות חשיבותה במספר מחלות כגון סרטן ניוון עצבי 5,26. בנוסף, מכיוון שהמבנים של BrdU ו-EdU דומים מאוד, רוב נוגדני BrdU מציגים תגובתיות צולבת כלפי EdU, שיש לקחת בחשבון כאשר מכוונים לניסויי תיוג כפול27. צביעת RPA שימשה בעבר להצגת מוקדי ssDNA בעיקר בתאי שלב S; עם זאת, כמה מאמרים השתמשו בו בהצלחה גם מחוץ לשלב S 28,29,30,31,32,33,34,35. הפרוטוקול הבא מנצל ביעילות את התכונות של RPA, ומאפשר הדמיה של מוקדי ssDNA בעקבות נזק לדנ”א בשלב G1 של מחזור התא (אם כי ניתן להשתמש בו בכל שלבי מחזור התא).
Protocol
Representative Results
Discussion
שמירה על תרבית תאים בריאה ונטולת מיקופלסמה היא קריטית לכל הניסויים שתוארו לעיל. לתאי RPE1 יש חיבור חזק לכלי פלסטיק המטופלים בתרבית רקמות תחת אמצעי תרבית רגילים; עם זאת, מאפייני הקשירה שלהם פוחתים באופן משמעותי כאשר הם נשמרים בתנאים נטולי סרום. בנוסף, כדי לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה של מוקדי ssDNA תחת מיקרוסקופ, התאים צריכים להיות מצופים על זכוכית כיסוי בעובי 0.17 מ”מ, שאינה הידרופילית מספיק כדי לתמוך בחיבור תקין של תאי RPE1. ללא תאים שטוחים כראוי ומפוזרים באופן שווה, זה מאתגר מאוד לדמיין מוקדי ssDNA בודדים. לכן, קריטי לבחור את חומר הציפוי המתאים (למשל, ויטרונקטין) ולהשאיר מספיק זמן (6-12 שעות) לתאים להתפשט ולהתחבר לאחר שחרורם לשלב G1.
חלק מאתגר בפרוטוקול הוא להשיג תאי RPE1 הומוגניים מסונכרנים G1. זה דורש שני שלבים קריטיים. ראשית, להרעבה יעילה בסרום, יש לבצע טריפסיניזציה, לשטוף ביסודיות עם PBS ולזרוע ישירות על צלחות תרבית רקמות חדשות באמצעות מדיה נטולת סרום. שטיפת התאים ישירות בכלי תרבית רקמה להסרת הסרום לא תניב סנכרון G0 יעיל. שנית, כאשר משחררים תאים לשלב G1, יש לבצע שוב טריפסינזציה ולזרוע אותם על צלחות תרבית רקמה טריות. באופן דומה, רק שינוי המדיום והוספת מדיום גידול המכיל סרום לתאים לא יביא לכניסה סינכרונית של G1. בנוסף, עבור כניסה נכונה של G1, צפיפות הזריעה של התאים על משקפי הכיסוי המצופים חייבת להיות ברמות מפגש מסוימות. בעוד סנכרון תאים מושלם הוא בדרך כלל בלתי ניתן להשגה, פרוטוקול סנכרון זה המתואר כאן נותן ~ 97% אוכלוסיית G1 טהורה. צפיפות הזריעה המומלצת עבור RPE1 על כיסוי בקוטר 12 מ”מ היא ~ 4 × 104 כדי לרכוש שדה ראייה הומוגני להדמיה, עם מפגש של כ -70%. צפיפות זריעה גבוהה יותר גורמת לתאים להתנתק ו”להתקלף” לאחר מיצוי CSK ותגרום לאות רקע גבוה יותר במהלך רכישת התמונה.
כדי להפחית כל אות רקע ולהשיג יחס אות לרעש חיובי, שטיפה יסודית לאחר דגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים היא חיונית. מכיוון שיש ליישם שלבי שטיפה רבים, חיוני גם למנוע מהבאר להתייבש במהלך כל שלב כביסה. אנו ממזערים חפץ זה על ידי יישום מינימום של 0.05% Triton X-100 בכל שלבי הכביסה והדגירה. לאחר שהבארות התייבשו, התאים הציגו יחס אות לרעש שונה; זה מוביל לתבנית דמוית פסיפס מתחת למיקרוסקופ ועלול להפריע להערכה. רכישת תמונה Z-stack בשילוב עם deconvolution יכולה לסייע בלכידת מוקדים במישורי מוקד שונים כדי לשפר את הניתוח.
שיטות קונבנציונליות מסתמכות על זיהוי של BrdU משולב בתנאים שאינם דנטורציה. שיטות אלה, עם זאת, תלויות בטיפול מקדים של תאים עם מינונים גבוהים של BrdU לפחות 1-2 ימים (או זמן שווה ערך מחזור התא המלא בקו התא בשימוש) כדי להבטיח שילוב גנומי אחיד. באופן בלתי נמנע, שילוב נרחב של BrdU עלול לגרום להפרעה במחזור התא36. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, שיטה זו משתמשת ב- RPA2 אנדוגני כדי לזהות מוקדי ssDNA. גישה זו אינה דורשת שילוב BrdU מונחה שכפול, ניתן להשתמש בה גם בתאים פוסט-מיטוטיים. מכיוון שאין צורך בשילוב נרחב של BrdU, הדבר חוסך זמן ומפחית את מורכבות הניסוי. על ידי שימוש בצביעת RPA2 כדי להמחיש ssDNA, אנו יכולים להשתמש ב-2′-deoxy-5-ethynyluridine (EdU) ובכימיית קליקים כדי לסמן שכפול DNA תוך הימנעות מתגובתיות צולבת אפשרית של נוגדני BrdU כנגד EdU 27,37,38. יש לנקוט בזהירות מיוחדת כדי להסוות כראוי את ה- EdU המשולב במהלך תגובת הלחיצה, כך שהנוגדנים BrdU לא יגיבו בהצלבה עם EdU27,39.
לבסוף, יתרון חשוב בשימוש ב-RPA2 במקום ב-BrdU הוא פשוט יחס אות לרעש מעולה בהשוואה לצביעת BrdU מחוץ לשלב S. מצאנו שצביעת BrdU ללא דנטורציה והיכולת שלה לדמיין ssDNA מוגבלת לשלב S אפילו בתאים משוכפלים (איור 2). נוגדן BrdU נקשר רק ל- BrdU החשוף מספיק במתיחות ssDNA. קשירה של חלבוני תיקון, כולל RPA2, למתיחות ssDNA עלולה לדכא או לעכב את החשיפה המספקת של BrdU ב- ssDNA. מצאנו גם כי מיצוי מראש של CSK נחוץ להדמיית ssDNA באמצעות נוגדן BrdU. הדבר אפשרי מכיוון שעקבות ssDNA אינן נגישות לנוגדן מבלי להסיר מהן רכיבי חלבון הקשורים קלות.
עם זאת, ישנן כמה מגבלות הקשורות לפרוטוקול זה. מגבלה של שימוש ב- RPA2 לזיהוי ssDNA היא הצורך לייעל את שלב החילוץ מראש של CSK. עודף RPA2 לא קשור חייב להישטף מהדנ”א לפני קיבוע התאים. מצד אחד, תת-מיצוי מוביל לרקע גבוה בגלל מקטע החלבון RPA2 שאינו קשור ל-ssDNA. מצד שני, מיצוי יתר יוביל לאובדן אות. עבור זיהוי BrdU, זה אינו משתנה מכיוון ש- BrdU משולב ביציבות ב- DNA ולא ניתן לשטוף אותו על ידי מיצוי מראש. לכן, יש לשקול בזהירות את זמן החילוץ מראש של CSK, את כמות Triton X-100 בחיץ, את הנפח ואת הטמפרטורה שבה מתבצע החילוץ מראש. חילוץ מוקדם של CSK גם מגביל את השימוש בגודל הגרעין כדי להבחין בין תאי G0/G1 לתאי S/G2.
בנוסף, איננו יכולים לשלול את האפשרות שחלק מהאות שמגיע מ-RPA2 מקורו בכך שהוא קשור לאינטראקטורים אחרים של חלבונים קושרי כרומטין. יש גם לקחת בחשבון את ספציפיות המין של נוגדן RPA2. הנוגדן המשמש בפרוטוקול זה יכול לזהות RPA2 של בני אדם, עכברים, חולדות, אוגרים וקופים. מגבלה נוספת של גישה זו היא שלא כל קווי התאים יכולים להיות מורעבים בסרום לסנכרון G0. רוב קווי התאים הסרטניים יכולים לעקוף את נקודות הביקורת של מחזור התא ולהתרבות אפילו במדיה נטולת נסיוב. למרות שרעב בסרום מועיל, מכיוון שהוא אינו גורם נזק לדנ”א, יש לעקוב בקפידה אחר יעילות סנכרון התאים שלהם כדי לוודא שמושגת העשרה נכונה של שלב מחזור התא. עבור תאים שאינם מגיבים לחסך בסרום, יש לשקול שיטות אחרות לסנכרון תאים (למשל, ניעור מיטוטי, עיכוב CDK1 למעצר G2, או טכניקות לא פולשניות כגון אילוטריציה צנטריפוגלית). שיטה אפשרית נוספת היא שימוש בהדמיה בתוכן גבוה כדי למדוד EdU ותכולת DNA גרעיני עבור פרופיל מחזור התא של תאים אסינכרוניים31. יש לשקול את ההשלכות של שימוש בשיטות סנכרון חלופיות כדי למנוע הפרעה לניתוח במורד הזרם. לדוגמה, השימוש בבלוק תימידין כפול או אפידיקולין, המשמש לעתים קרובות בספרות, יגרום ללחץ שכפול ולנזק לדנ”א40.
חקירת מנגנוני תיקון הדנ”א ממשיכה להוות מוקד דיון מרכזי בתחומי הסרטן והביולוגיה של התא. הפרוטוקול המוצג כאן מציע גישה רבת ערך להכנת תאים, המאפשרת הדמיה וניתוח כמותי של ssDNA עם חשיפה לחומרים מזיקים לדנ”א. יש לציין כי פרוטוקול זה מדגיש את השימוש בחלבון קושר ssDNA, RPA2, ומדגים את הספציפיות הגבוהה שלו כדי לדמיין כמויות קטנות של מוקדי ssDNA תוך הימנעות מתגובתיות צולבת לא רצויה בכל שלבי מחזור התא. השימוש ב-RPA2 מעניק יתרונות רבים, במיוחד עבור חוקרים השואפים לנתח תאים בשלב G1 של מחזור התא. פרוטוקול זה לוקח בחשבון מספר מגבלות ומטפל בחששות הקשורים להפרעות אותות, רעשי רקע לא רצויים ותגובתיות צולבת בעת שימוש בצביעת RPA2 או BrdU לזיהוי ssDNA.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למישל פגאנו על תמיכתו ותובנותיו המועילות, לאשלי צ’וי ושרון קייסארי על קריאה ביקורתית של כתב היד, ולג’פרי אסטרדה ווילמה דיאז על תמיכתם המתמשכת. עבודה זו נתמכה על ידי תוספת גיוון למענק המכונים הלאומיים לבריאות GM136250.
Materials
| Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
| Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
| Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
| BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
| CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
| Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
| cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
| Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
| Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
| DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
| D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
| Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
| EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analog |
| Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
| Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
| Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
| FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
| hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
| Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
| Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
| Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
| Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
| MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
| NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
| onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
| p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
| PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
| PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
| pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
| PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
| Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
| Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
| Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
| Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
| Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
| Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
| Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |
References
- Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and ugly. EMBO J. 27 (4), 589-605 (2008).
- Gutierrez, R., O’Connor, T. R. DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance. Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).
- Krokan, H. E., Bjoras, M. Base excision repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583 (2013).
- Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).
- Li, G. M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 18 (1), 85-98 (2008).
- Hustedt, N., Durocher, D. The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol. 19 (1), 1-9 (2016).
- Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
- Bhat, D. S., et al. Therapeutic disruption of RAD52-ssDNA complexation via novel drug-like inhibitors. NAR Cancer. 5 (2), zcad018 (2023).
- Gupta, P., Saha, B., Chattopadhyay, S., Patro, B. S. Pharmacological targeting of differential DNA repair, radio-sensitizes WRN-deficient cancer cells in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 186, 114450 (2021).
- Pena-Diaz, J., et al. Noncanonical mismatch repair as a source of genomic instability in human cells. Mol Cell. 47 (5), 669-680 (2012).
- Schroering, A. G., Edelbrock, M. A., Richards, T. J., Williams, K. J. The cell cycle and DNA mismatch repair. Exp Cell Res. 313 (2), 292-304 (2007).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Genschel, J., Modrich, P. Mechanism of 5′-directed excision in human mismatch repair. Mol Cell. 12 (5), 1077-1086 (2003).
- Hu, J., et al. Nucleotide excision repair in human cells: fate of the excised oligonucleotide carrying DNA damage in vivo. J Biol Chem. 288 (29), 20918-20926 (2013).
- Huertas, P., Jackson, S. P. Human CtIP mediates cell cycle control of DNA end resection and double strand break repair. J Biol Chem. 284 (14), 9558-9565 (2009).
- Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in DNA replication with putative roles in cancer. Int J Mol Sci. 20 (1), 74 (2018).
- Symington, L. S. End resection at double-strand breaks: mechanism and regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (8), a016436 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair. J Biol Chem. 280 (5), 3665-3674 (2005).
- Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
- Wienholz, F., Vermeulen, W., Marteijn, J. A. Amplification of unscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cell quantification of transcription-coupled nucleotide excision repair. Nucleic Acids Res. 45 (9), e68 (2017).
- Wold, M. S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: single-stranded DNA’s first responder: dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. Bioessays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Kang, Y., et al. Alteration of replication protein A binding mode on single-stranded DNA by NSMF potentiates RPA phosphorylation by ATR kinase. Nucleic Acids Res. 51 (15), 7936-7950 (2023).
- Kilgas, S., Kiltie, A. E., Ramadan, K. Immunofluorescence microscopy-based detection of ssDNA foci by BrdU in mammalian cells. STAR Protoc. 2 (4), 100978 (2021).
- Madabhushi, R., Pan, L., Tsai, L. H. DNA damage and its links to neurodegeneration. Neuron. 83 (2), 266-282 (2014).
- Liboska, R., Ligasova, A., Strunin, D., Rosenberg, I., Koberna, K. Most anti-BrdU antibodies react with 2′-deoxy-5-ethynyluridine — the method for the effective suppression of this cross-reactivity. PLoS One. 7 (12), e51679 (2012).
- Biehs, R., et al. DNA double-strand break resection occurs during non-homologous end joining in G1 but is distinct from resection during homologous recombination. Mol Cell. 65 (4), 671-684.e5 (2017).
- Cruz-Garcia, A., Lopez-Saavedra, A., Huertas, P. BRCA1 accelerates CtIP-mediated DNA-end resection. Cell Rep. 9 (2), 451-459 (2014).
- Ercilla, A., et al. Physiological tolerance to ssDNA enables strand uncoupling during DNA replication. Cell Rep. 30 (7), 2416-2429.e7 (2020).
- Lezaja, A., et al. RPA shields inherited DNA lesions for post-mitotic DNA synthesis. Nat Commun. 12 (1), 3827 (2021).
- Mukherjee, B., Tomimatsu, N., Burma, S. Immunofluorescence-based methods to monitor DNA end resection. Methods Mol Biol. 1292, 67-75 (2015).
- Ochs, F., et al. 53BP1 fosters fidelity of homology-directed DNA repair. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 714-721 (2016).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Forment, J. V., Walker, R. V., Jackson, S. P. A high-throughput, flow cytometry-based method to quantify DNA-end resection in mammalian cells. Cytometry A. 81 (10), 922-928 (2012).
- Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Sci Rep. 6, 19567 (2016).
- Aten, J. A., Bakker, P. J., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. Histochem J. 24 (5), 251-259 (1992).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-phase labeling of dividing stem cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. Cell proliferation method: click chemistry based on BrdU coupling for multiplex antibody staining. Curr Protoc Cytom. Chapter 7, (2008).
- Ligasova, A., Koberna, K. Strengths and weaknesses of cell synchronization protocols based on inhibition of DNA synthesis. Int J Mol Sci. 22 (19), 10759 (2021).
