細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

G1におけるssDNA検出の限界を克服するために、我々は、ssDNA焦点検出の特異性と強度の両方を高めるRPA2を利用した35。正確な細胞同期を実現するために、効率的に血清を欠乏させ、G0期に同期させることができるRPE1細胞を使用しました。その後、血清欠乏後の血清の添加により、細胞周期に再び入るように誘導することができます。同期効率を確認するために、細胞をEdUで標識し、そのDNA含有量をヨウ化プロピジウムで標識しました。さらに、フローサイトメトリーにより定性的および定量的な結果を収集しました(補足図S1A)。ドットプロットは、72時間の血清飢餓後、細胞の~98%がG0期にあることを示しています。血清含有培地を6時間添加した後、細胞は細胞周期に再入りし( 図1Aのp27レベルの増加に見られるように)、G1には~97%の細胞があるのに対し、S期には<1%の細胞しかなく、G2期には<2%の細胞しかありません(補足図S1A)。細胞に血清を20〜28時間添加した後、フローサイトメトリープロット(補足図S1A)に示すように、細胞は徐々にS期を通過します。このセル同期のプロトコルは~97%の純粋なG1人口(血清の飢餓の72時間の後の6時間のポストの血清の付加)を与える。同期効率をさらに検証するために、ウェスタンブロッティング(図1A および 補足図S1B)を使用して血清放出後の細胞周期マーカーの発現を比較し、並行してEdU取り込みアッセイを実施してDNA複製を可視化しました。また、EdU染色では、同期効率とG1期でのDNA複製の欠如が強調されています(図1B、C)。 哺乳類細胞中のssDNAを検出する従来の方法は、ssDNA中のBrdUの検出に依存しています。図2Aは、H2O2およびネオカルチノスタチン(NCS)処理において、BrdU焦点はS期細胞においてのみ検出可能であったが、非S期細胞ではssDNA病巣は検出できなかったことを示している。また、BrdU抗体染色では、細胞周期の段階や適用された処理に関係なく、すべての核で検出できる顕著な核小体バックグラウンド染色が示されました。ここで説明した EdU クリックプロトコルでは、図 2A の未処理サンプルで明らかなように、EdU と BrdU の焦点の共局在を検出できませんでした。交差反応性から生じるBrdUシグナルを完全に排除するために、EdU標識を避け、サイクリンA2をS-G2マーカーとして使用しました。しかし、サイクリンA2染色ではCSKの予備抽出はできず、この条件下では、遺伝毒性ストレス後でもBrdU病巣は見られませんでした(補足図S2A)。このことは、抗BrdUベースのssDNA染色にはCSKの予備抽出が必要であるという事実を浮き彫りにしています。コントロールとして、変性条件下でのBrdU抗体染色試験を行いました。これにより、DNAが開き、取り込まれたBrdUが露出し、BrdUが均一に取り込まれたことが明らかになった(補足図S2B)。 対照的に、RPA2染色は、S期だけでなく、他の細胞周期期でもNCSおよびH2O2依存性病巣形成を示します(図2B)。また、対照として、複製中の細胞にのみssDNAが蓄積するHUで細胞を処理しました。予想通り、EdU陽性細胞のRPA2抗体によるHU処理でのみシグナル増加が検出され、このアプローチの特異性が浮き彫りになりました。RPA2抗体は、外因性の遺伝毒性ストレスがない場合でも、複製中に自然に発生するssDNA形成を検出することができます(図2B)。RPA2抗体の感度が高いことから、従来のBrdU染色では遺伝毒性ストレスによるシグナルを検出できなかったG1期にRPA2抗体を利用しようとしました(補足図S2C)。図3Aは、H2O2処理時のssDNA病巣の形成が、抗RPA2抗体を用いた場合、G1においても検出可能であったことを示している。H2O2処理時に、これらの核におけるRPA2病巣の数が有意に増加した(図3B)。これらの病巣はRPA2に特異的であり、RPA2のサイレンシングはIF信号を消失させました(図3A、B)。図3Cおよび補足図S1Cは、これらのセルにおけるRPA2サイレンシングの効率を示しています。RPA2によるssDNAの検出は、従来法と比較して感度が高いため、G1期細胞への応用が可能です。 図1:血清飢餓後のRPE1細胞の同期効率。 (A)イムノブロットは、非同期、G1、およびS期同期RPE1細胞におけるタンパク質レベルを示します。(B)代表的な画像は、固定前に10 μM EdUに30分間曝露し、Click-IT反応によって可視化した非同期、G1、およびS期同期RPE1細胞を示しています。DAPIは、核DNAの対比染色に使用されました。スケールバー = 50 μm。 (C)グラフは、DAPIで評価した全細胞集団に対するEdU陽性細胞の割合を示しています。エラーバーは平均の標準誤差を表し、分析された核の数は、AS n = 219、G1 n = 630、S n = 437でした。略語:RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;AS = 非同期;EdU = 5-エチニル-2′-デオキシウリジン;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:DNA損傷時のBrdU抗体またはRPA2抗体によるssDNA検出。 (A)代表的な画像はαBrdUを用いたssDNA病巣(緑)、S期細胞はEdU(紫色)、DAPIを用いた核DNAの対比染色(青色)を示しています。RPE1細胞は、追加処理の前に10μMのBrdUで48時間保持しました。48時間後、細胞を10μMのEdUで30分間パルスした後、H2O2(250μM)を1時間またはネオカルチノスタチン(0.5μg/mL)で4時間処理した。細胞はCSK前抽出後に固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 5 μm。右のパネルは、示されたS期または非S期の核の拡大画像です。(B)代表画像はαRPA2抗体を用いたssDNA病巣(緑)。S期細胞はEdU(紫色)で強調表示されており、DAPIは核DNAの対比染色(青色)に使用されました。RPE1細胞を10μMのEdUで30分間パルスした後、1時間H2O2(250μM)、4時間のヒドロキシ尿素(2mM)、または4時間のNCS(0.5μg/mL)のいずれかでパルス化しました。細胞はCSK前抽出後に固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 10 μm。右のパネルは、示されたS期または非S期の核の拡大画像です。略語:ssDNA = 一本鎖DNA;BrdU = 5-ブロモ-2′-デオキシウリジン;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;EdU = 5-エチニル-2′-デオキシウリジン;NCS = ネオカルチノスタチン;HU = ヒドロキシ尿素。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:RPA2抗体を用いたG1期のssDNA病巣の検出。 (A)RPE1細胞に、RPA2を標的とするsiRNAまたは非標的siRNAコントロールのいずれかをトランスフェクションし、続いてG1で同期し、10μMのEdUで30分間パルス標識した後、必要に応じてH2O2(250μM)で1時間処理しました。 DAPIは、核DNAの対比染色に使用されました。細胞はCSK前抽出後に固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 5 μm。 (B)RPA2の病巣/核の数の測定は、2つの独立した実験から行われました。分析中に考慮されたのは、EdU陰性細胞のみです。線はプロットの平均値を表します。統計分析のためにノンパラメトリック分散分析検定(Kruskal-Wallis)を実行しました。星印は P < 0.0001 を示しています。分析した核数は、siNTなしH2O2n=513、siNTH2O2n=603、siRPA2なしH2O2n=266、siRPA2H2O2n=536であった。(C)siRNAノックダウンの効率は、イムノブロッティングで示されています。略語: siNT = non-targeting siRNA control;BrdU = 5-ブロモ-2′-デオキシウリジン;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;EdU = 5-エチニル-2′-デオキシウリジン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:フィジーを用いたssDNA病巣の定量。核内のRPA2病巣数を評価する方法を示すフィジーでの詳細な手順。(A-E)DAPIチャネルを使用した核マスクの作成。(F-H)バックグラウンドシグナルから個々の核 ssDNA 病巣を特定するための閾値処理。略語:ssDNA = 一本鎖DNA;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 細胞骨格(CSK)バッファー パイプpH 7.0 10ミリメートル NaCl(ナトリウム) 100ミリメートル EDTAのpH 8 1ミリメートル MgClの2  3ミリメートル D-スクロース 300ミリメートル トリトンX-100 0.20% ホスファターゼ阻害剤カクテル 10mLあたり1錠 プロテアーゼ阻害剤カクテル 10mLあたり1錠 ddH2Oで希釈 該当なし 洗浄バッファー トリトンX-100 0.05% PBSで希釈 該当なし 透過処理バッファー トリトンX-100 0.50% PBSで希釈 該当なし 固定ソリューション パラホルムアルデヒド 3.60% トリトンX-100 0.05% PBSで希釈 該当なし ブロッキングバッファ ウシ血清アルブミン(BSA) 5% トリトンX-100 0.10% PBSで希釈 該当なし Click-iT Plusリアクションカクテル 1x Click-iT 反応バッファー 435 mLの Alexa Fluor PCAソリューション 5 mLの CuSO4銅保護剤プレミックス 10 mLの 1x Click-iT バッファー添加剤 50 mLの 総ボリューム 500 mLの 表1:このプロトコルで使用されるバッファーの構成。 補足図S1。 (A)RPE1細胞は、血清飢餓状態を72時間使用してG0期に同期させ、その後、血清を再導入することにより、異なる細胞周期期に放出した。ドットプロットは、G0/G1、S、またはG2/M期の細胞を示し、時間は血清飢餓後の血清の再添加後の時間を示します。右のグラフは、各条件におけるG0/G1、S、G2/Mセルの割合を示しています。FACS分析は、メーカーの推奨に従って、EdUおよびヨウ化プロピジウムを使用した市販の細胞増殖キットを使用して実施しました。(B) 図1のトリミングされていないウェスタンブロットスキャン。数値は分子量マーカーをkDaで示しています。PARP1をローディングコントロールとして使用し、メンブレンを切断することにより、CCNA2、p27(PCNA用にさらに剥離)、およびpH3(S10)(H3用にさらに剥離)に対しても開発されたゲルにロードしました。CCNB1 と RPA2 を別々のゲルにロードし、同量のタンパク質ライセートを使用して比較可能性を確保しました。(C) 図3のトリミングされていないウェスタンブロットスキャン。数値は分子量マーカーをkDaで示しています。略語:EdU = 5-エチニル-2′-デオキシウリジン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図S2:(A)代表的な画像は、BrdU抗体を用いたssDNAの病巣を示す(緑)。S期細胞はサイクリンA2(赤)で強調表示されます。DAPIは核DNA(青)の対比染色に使用されました。RPE1細胞を10μMのBrdUに48時間浸かってから、さらに処理しました。48時間後、細胞をH2O2(250μM)で1時間処理するか、ネオカルチノスタチン(0.5μg/mL)で4時間処理してから固定した。白い破線は、各核の境界を示します。スケールバー = 5 μm。 (B)変性条件ありおよびなしのRPE1細胞のBrdU染色。非同期RPE1細胞を10μMのBrdUで48時間前処理しました。スケールバー = 10 μm。 (C)BrdUの病巣/核の数の測定は、G1同期RPE1細胞における2つの独立した実験から実施されました。分析中に考慮されたのは、EdU陰性細胞のみです。線はプロットの平均値を表します。統計分析のためにノンパラメトリック分散分析検定(Kruskal-Wallis)を実行しました。「ns」は有意でない差を示します。分析された核の数は、NT n=52、NCS n = 105、H2O2 n = 82であった。略語: siNT = non-targeting siRNA control;BrdU = 5-ブロモ-2′-デオキシウリジン;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;RPE1 = hTERT不死化網膜色素上皮細胞;NCS = ネオカルチノスタチン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ビデオS1:フィジーベースのRPA2焦点分析の画面録画。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。