تصور بؤر الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية
Summary
يقدم البروتوكول التالي الكشف عن بؤر الحمض النووي التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية باستخدام مزامنة دورة الخلية متبوعة بتلطيخ RPA2 المناعي.
Abstract
خصص الحمض النووي مسارات إصلاح خلوية قادرة على التعامل مع الآفات التي يمكن أن تنشأ من مصادر داخلية و / أو خارجية. يتطلب إصلاح الحمض النووي التعاون بين العديد من البروتينات ، المسؤولة عن تغطية مجموعة واسعة من المهام من التعرف على وجود آفة الحمض النووي والإشارة إليها إلى إصلاحها جسديا. خلال هذه العملية ، غالبا ما يتم إنشاء مسارات الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) ، والتي يتم ملؤها في النهاية بواسطة بوليميراز الحمض النووي. طبيعة مسارات ssDNA هذه (من حيث الطول والعدد) ، جنبا إلى جنب مع البلمرة التي تم تجنيدها لملء هذه الفجوات ، هي مسار إصلاح محدد. يمكن أن يساعدنا تصور مسارات ssDNA هذه في فهم الديناميات المعقدة لآليات إصلاح الحمض النووي.
يوفر هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد الخلايا المتزامنة G1 لقياس تكوين بؤر ssDNA عند الإجهاد السمي الجيني. باستخدام نهج التألق المناعي سهل الاستخدام ، نتصور ssDNA عن طريق تلطيخ RPA2 ، وهو أحد مكونات مركب بروتين النسخ المتماثل غير المتجانس A (RPA). ترتبط تقنية RPA2 بوسيطات ssDNA التي تنشأ عند الإجهاد السمي الجيني أو النسخ المتماثل وتثبيطها للتحكم في إصلاح الحمض النووي وتنشيط نقطة فحص تلف الحمض النووي. يستخدم تلطيخ 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) لتصور تكرار الحمض النووي لاستبعاد أي خلايا طور S. يوفر هذا البروتوكول نهجا بديلا للمقايسات التقليدية القائمة على 5-برومو-2′-ديوكسييوريدين (BrdU) غير المسخ وهو أكثر ملاءمة للكشف عن بؤر ssDNA خارج المرحلة S.
Introduction
للحفاظ على الحياة ، تقوم الخلايا باستمرار بمسح وإصلاح الحمض النووي للحفاظ على سلامتها الجينومية. قد تتراكم الخلايا أنواعا مختلفة من تلف الحمض النووي بسبب كل من المصادر الداخلية (على سبيل المثال ، الأكسدة ، الألكلة ، نزع الأمين ، أخطاء النسخ المتماثل) والخارجية (مثل الأشعة فوق البنفسجية ، التشعيع المؤين) لضغوط الحمض النووي. يؤدي الفشل في إصلاح هذه الآفات إما إلى موت الخلايا المبرمج أو توقف دورة الخلية أو الشيخوخة ويمكن أن يؤدي إلى الأمراض1. يمكن معالجة آفات الحمض النووي من خلال أي من مسارات إصلاح الحمض النووي الرئيسية التالية: DR (إصلاح الانعكاس المباشر) ، والذي يصلح بشكل أساسي قواعد الألكيلات2 ؛ BER (إصلاح استئصال القاعدة) ، والذي يستهدف أخطاء قواعد الحمض النووي غير الضخمة وفواصل الحمض النووي أحادية الشريط (SSBs) 3 ؛ NER (إصلاح استئصال النوكليوتيدات) تصحيح آفات الحمض النووي الضخمة المشوهة للحلزون4 ؛ MMR (إصلاح عدم التطابق) يستهدف بشكل أساسي عدم تطابق الحمض النووي ، وحلقات الإدراج / الحذف (IDLs) ، وبعض الأضرار الأساسية5 ؛ NHEJ (الانضمام النهائي غير المتماثل) و HRR (إصلاح إعادة التركيب المتماثل) كلاهما نشط في فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل (DSBs)6 ؛ و TLS (تخليق الآفة) ، وهي آلية تجاوز آفة الحمض النووي7. على الرغم من أن هذه المسارات لها خصائص ركيزة مميزة ، إلا أن هناك بعض التداخلات بينها لضمان التكرار للإصلاح الفعال. يعد فهم عمل مسارات إصلاح الحمض النووي المختلفة في مراحل دورة الخلية المختلفة أمرا بالغ الأهمية لأن عوامل إصلاح الحمض النووي هذه يمكن أن تكون بمثابة أهداف أساسية للنهج العلاجية لعلاج السرطان والشيخوخة والاضطرابات العصبية 8,9.
يتم إنشاء الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) طوال دورة الخلية بسبب إصلاح آفات الحمض النووي الناتجة عن كل من العوامل الضارة بالحمض النووي الداخلية والخارجية. عند الإجهاد السام الجيني ، يتم إنشاء ssDNA بكثرة في المرحلتين S و G2 حيث يكون ل HRR و MMR أعلى نشاط لهما وعندما تتوقف آلية النسخ المتماثل أو تنهار عند مواجهة آفات الحمض النووي6،10،11. مسارات إصلاح الحمض النووي الأخرى (على سبيل المثال ، NHEJ / الانضمام النهائي بوساطة microhomology (MMEJ) / التلدين أحادي الشريط [SSA]) تولد أيضا ssDNA أثناء إصلاح DSB12. عادة ما تنشأ مسارات ssDNA هذه من استئصال الحمض النووي ، الذي يتم تنفيذه بواسطة exonucleases مثل EXO1 و DNA2 و CtIP أثناء HR و MMR ، والنوكليازات الداخلية مثل XPF و XPG أثناء NER ، أو من خلال العمل المشترك ل POLB و FEN1 خلال BER4،13،14،15،16،17،18،19. نظرا لعمل آلية النسخ المتماثل ، يتم إنشاء مسارات ssDNA أيضا عندما تقوم حلزونات الحمض النووي بفك الحمض النووي أمام البلمرة المتماثلة المرتبطة بPCNA 20. في المقابل ، في المرحلة G1 ، يقلل نقص HRR وتكرار الحمض النووي والنشاط المحدود ل MMR من مدى مسارات ssDNA المتولدة وبالتالي يكون اكتشاف10،11،21 أكثر صعوبة.
مسارات ssDNA الخلوية هي هياكل حساسة للغاية يجب حمايتها لتجنب تكوين DSBs. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء مسارات ssDNA باستخدام RPA. RPA عبارة عن مركب بروتين غير متجانس وفير يتكون من وحدات فرعية متعددة (RPA1 و RPA2 و RPA3 ، يشار إليها أيضا باسم RPA70 و RPA32 و RPA14 ، على التوالي) ، والتي يتم التعبير عنها في كل مكان طوال دورة الخلية22. تحتوي كل وحدة فرعية RPA على مجال ربط الحمض النووي (DBD) ، قادر على التفاعل مع 4-6 نيوكليوتيدات ، وتشكل الوحدات الفرعية المدمجة نواة تشذيب مستقرة. إجمالا ، يرتبط RPA بحوالي 20-30 نيوكليوتيدات مع تقارب شبه نانوي23,24.
تستخدم الطرق التقليدية الفحص المجهري المناعي (IF) لتصور بؤر ssDNA عن طريق وضع علامات على 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) المدمجة في الحمض النووي الجينومي باستخدام الأجسام المضادة BrdU25. يعتمد هذا النهج على حقيقة أن الأجسام المضادة BrdU يمكنها فقط اكتشاف BrdU في ssDNA25 المكشوف. على الرغم من أن هذا النهج واضح ومباشر ، إلا أنه يعرض أيضا بعض القيود. على سبيل المثال ، تتم معالجة الخلايا مسبقا لدمج BrdU قبل بدء التجربة ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا ويمكن أن يتداخل مع المستجيبات النهائية. لذلك ، يقتصر اكتشاف ssDNA المستند إلى BrdU على تكرار الخلايا ولا يمكن استخدامه للخلايا الهادئة. هذا يستثني تطبيق هذه الطريقة لدراسة إصلاح الحمض النووي في الخلايا غير المتكاثرة على الرغم من أهميتها في العديد من الأمراض مثل السرطان والتنكس العصبي 5,26. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هياكل BrdU و EdU متشابهة جدا ، فإن معظم الأجسام المضادة BrdU تظهر تفاعلا متقاطعا تجاه EdU ، والذي يجب مراعاته عند استهداف تجارب وضع العلامات المزدوجة27. تم استخدام تلطيخ RPA سابقا لإظهار بؤر ssDNA بشكل رئيسي في خلايا المرحلة S. ومع ذلك ، فقد استخدمته بعض الأوراق بنجاح خارج المرحلة S28،29،30،31،32،33،34،35. يستخدم البروتوكول التالي خصائص RPA بكفاءة ، مما يسمح بتصور بؤر ssDNA بعد تلف الحمض النووي في المرحلة G1 من دورة الخلية (على الرغم من أنه يمكن استخدامه في جميع مراحل دورة الخلية).
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الحفاظ على ثقافة خلايا صحية خالية من الميكوبلازما أمرا بالغ الأهمية لجميع التجارب الموضحة أعلاه. خلايا RPE1 لها ارتباط قوي بالأدوات البلاستيكية المعالجة بزراعة الأنسجة تحت وسائط الاستزراع العادية. ومع ذلك ، فإن خصائصها الملزمة تتضاءل بشكل كبير عند الاحتفاظ بها في ظروف خالية من المصل. بالإضافة إلى ذلك ، لالتقاط صور عالية الدقة لبؤر ssDNA تحت المجهر ، يجب طلاء الخلايا على زجاج غطاء بسمك 0.17 مم ، وهو غير محب للماء بما يكفي لدعم الارتباط المناسب لخلايا RPE1. بدون خلايا مسطحة بشكل صحيح وموزعة بالتساوي ، من الصعب للغاية تصور بؤر ssDNA الفردية. لذلك ، من الأهمية بمكان اختيار مادة الطلاء المناسبة (على سبيل المثال ، فيترونيكتين) وترك وقت كاف (6-12 ساعة) للخلايا لتنتشر وتلتصق بعد إطلاقها في مرحلة G1.
يتمثل جزء صعب من البروتوكول في الحصول على خلايا RPE1 متزامنة متجانسة G1. وهذا يتطلب خطوتين حاسمتين. أولا ، من أجل تجويع المصل الفعال ، يجب أن تكون الخلايا تريبسين ، وتغسل جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتزرع مباشرة على أطباق زراعة الأنسجة الجديدة باستخدام وسائط خالية من المصل. غسل الخلايا مباشرة في أطباق زراعة الأنسجة لإزالة المصل لن يؤدي إلى مزامنة G0 فعالة. ثانيا ، عند إطلاق الخلايا في مرحلة G1 ، يجب أن تكون الخلايا التربسين مرة أخرى وبذرها على لوحات زراعة الأنسجة الطازجة. وبالمثل ، فإن مجرد تغيير الوسط وإضافة وسيط استزراع يحتوي على المصل إلى الخلايا لن يؤدي إلى إدخال G1 متزامن. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل الدخول الصحيح ل G1 ، يجب أن تكون كثافة البذر للخلايا الموجودة على زجاج الغطاء المطلي عند مستويات التقاء معينة. في حين أن مزامنة الخلايا المثالية غير قابلة للتحقيق بشكل عام ، فإن بروتوكول المزامنة هذا الموصوف هنا يعطي ~ 97٪ من السكان G1 النقي. كثافة البذر الموصى بها ل RPE1 على غطاء قطره 12 مم هي ~ 4 × 104 للحصول على مجال رؤية متجانس للتصوير ، مع التقاء 70٪ تقريبا. تتسبب كثافة البذر العالية في انفصال الخلايا و “تقشيرها” بعد استخراج CSK وستؤدي إلى إشارة خلفية أعلى أثناء التقاط الصورة.
لتقليل أي إشارة خلفية وتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء مواتية ، من الضروري إجراء غسيل شامل بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية والثانوية. نظرا لأنه يجب تطبيق العديد من خطوات الغسيل ، فمن الضروري أيضا منع جفاف البئر أثناء كل خطوة غسيل. نقوم بتقليل هذه القطعة الأثرية من خلال تطبيق ما لا يقل عن 0.05٪ Triton X-100 في جميع خطوات الغسيل والحضانة. بمجرد جفاف الآبار ، أظهرت الخلايا نسبة إشارة إلى ضوضاء متغيرة. هذا يؤدي إلى نمط يشبه الفسيفساء تحت المجهر ويمكن أن يتداخل مع التقييم. يمكن أن يساعد الحصول على صورة Z-stack جنبا إلى جنب مع إزالة الالتفاف في التقاط البؤر في مستويات بؤرية مختلفة لتحسين التحليل.
تعتمد الطرق التقليدية على اكتشاف BrdU المدمج في ظل ظروف غير مسخة. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطرق على المعالجة المسبقة للخلايا بجرعات عالية من BrdU لمدة 1-2 أيام على الأقل (أو وقت يعادل دورة خلية كاملة في خط الخلية المستخدم) لضمان دمج جينومي موحد. بشكل غير مرغوب فيه ، يمكن أن يتسبب دمج BrdU الشامل في تداخل دورة الخلية36. لمعالجة هذه القيود ، تستخدم هذه الطريقة RPA2 الداخلي للكشف عن بؤر ssDNA. لا يتطلب هذا النهج دمج BrdU المدفوع بالتكرار ، بل يمكن استخدامه أيضا في خلايا ما بعد الانقسام. نظرا لعدم الحاجة إلى دمج BrdU على نطاق واسع ، فإن هذا يوفر الوقت ويقلل من التعقيد التجريبي. باستخدام تلطيخ RPA2 لتصور ssDNA ، يمكننا استخدام 2′-deoxy-5-ethynyluridine (EdU) وكيمياء النقر لتمييز تكرار الحمض النووي مع تجنب التفاعل المتبادل المحتمل للأجسام المضادة BrdU ضد EdU27،37،38. يجب توخي الحذر بشكل خاص لإخفاء EdU المدمج بشكل صحيح أثناء تفاعل النقر حتى لا تتفاعل الأجسام المضادة BrdU مع EdU27,39.
أخيرا ، تتمثل إحدى الفوائد المهمة لاستخدام RPA2 بدلا من BrdU في وجود نسبة إشارة إلى ضوضاء فائقة عند مقارنتها بتلطيخ BrdU خارج مرحلة S. وجدنا أن تلطيخ BrdU غير المتنوع وقدرته على تصور ssDNA يقتصر على المرحلة S حتى في الخلايا المكررة (الشكل 2). يرتبط الجسم المضاد BrdU فقط ب BrdU المكشوف بدرجة كافية في امتدادات ssDNA. قد يؤدي ارتباط بروتينات الإصلاح ، بما في ذلك RPA2 ، بامتدادات ssDNA إلى قمع أو إعاقة التعرض الكافي ل BrdU في ssDNA. وجدنا أيضا أن الاستخراج المسبق ل CSK ضروري لتصور ssDNA باستخدام الجسم المضاد BrdU. هذا ممكن لأن مسارات ssDNA لا يمكن الوصول إليها للجسم المضاد دون إزالة مكونات البروتين المرتبطة قليلا منها.
ومع ذلك ، هناك بعض القيود المرتبطة بهذا البروتوكول. يتمثل أحد قيود استخدام RPA2 للكشف عن ssDNA في الحاجة إلى تحسين خطوة ما قبل الاستخراج CSK. يجب غسل RPA2 الزائد غير المنضم بعيدا عن الحمض النووي قبل تثبيت الخلايا. من ناحية ، يؤدي الاستخراج الناقص إلى خلفية عالية بسبب جزء بروتين RPA2 غير المرتبط ب ssDNA. من ناحية أخرى ، سيؤدي الإفراط في الاستخراج إلى فقدان الإشارة. بالنسبة للكشف عن BrdU ، هذا ليس متغيرا لأن BrdU مدمج بثبات في الحمض النووي ولا يمكن غسله عن طريق الاستخراج المسبق. لذلك ، يجب مراعاة وقت الاستخراج المسبق ل CSK ، وكمية Triton X-100 في المخزن المؤقت ، والحجم ، ودرجة الحرارة التي يتم عندها إجراء الاستخراج المسبق. يحد الاستخراج المسبق ل CSK أيضا من استخدام حجم النواة لتمييز خلايا G0 / G1 عن خلايا S / G2.
بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن تكون بعض الإشارات التي تأتي من RPA2 ناتجة عن ارتباطها بتفاعلات البروتين الأخرى المرتبطة بالكروماتين. يجب على المرء أيضا مراعاة خصوصية الأنواع للجسم المضاد RPA2. يمكن للجسم المضاد المستخدم في هذا البروتوكول التعرف على الإنسان والفأر والجرذ والهامستر RPA2. هناك قيد آخر لهذا النهج وهو أنه لا يمكن أن تكون جميع خطوط الخلايا متعطشة للمصل لمزامنة G0. يمكن لمعظم خطوط الخلايا السرطانية تجاوز نقاط تفتيش دورة الخلية والتكاثر حتى في الوسائط المحرومة من المصل. على الرغم من أن تجويع المصل مفيد ، لأنه لا يسبب تلف الحمض النووي ، يجب على المرء أن يراقب بعناية كفاءة مزامنة الخلايا للتأكد من تحقيق إثراء مرحلة دورة الخلية المناسبة. بالنسبة للخلايا التي لا تستجيب للحرمان من المصل ، يجب مراعاة طرق مزامنة الخلايا الأخرى (على سبيل المثال ، التخلص من الانقسام ، أو تثبيط CDK1 لإيقاف G2 ، أو التقنيات غير الغازية مثل التطهير بالطرد المركزي). طريقة أخرى ممكنة هي استخدام التصوير عالي المحتوى لقياس محتوى EdU والحمض النووي النووي لتوصيف دورة الخلية للخلايا غير المتزامنة31. يجب على المرء أن ينظر في الآثار المترتبة على استخدام طرق التزامن البديلة لمنع التداخل مع التحليل النهائي. على سبيل المثال ، سيؤدي استخدام كتلة الثيميدين المزدوجة أو أفيديكولين ، التي تستخدم غالبا في الأدبيات ، إلى إجهاد النسخ المتماثل وتلف الحمض النووي40.
لا يزال التحقيق في آليات إصلاح الحمض النووي نقطة محورية للمناقشة في مجالات السرطان وبيولوجيا الخلية. يقدم البروتوكول المقدم هنا نهجا قيما لإعداد الخلايا ، مما يتيح التصور والتحليل الكمي ل ssDNA عند التعرض للعوامل الضارة بالحمض النووي. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يسلط الضوء على استخدام بروتين ربط ssDNA ، RPA2 ، مما يدل على خصوصيته العالية لتصور كميات صغيرة من بؤر ssDNA مع تجنب التفاعل المتبادل غير المرغوب فيه في جميع مراحل دورة الخلية. يمنح استخدام RPA2 العديد من المزايا ، خاصة للباحثين الذين يهدفون إلى تحليل الخلايا في المرحلة G1 من دورة الخلية. يأخذ هذا البروتوكول في الاعتبار العديد من القيود ويعالج المخاوف المتعلقة بتداخل الإشارة وضوضاء الخلفية غير المرغوب فيها والتفاعل المتبادل عند استخدام تلطيخ RPA2 أو BrdU لاكتشاف ssDNA.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون ميشيل باغانو على دعمه وأفكاره المفيدة ، وآشلي تشوي وشارون كايساري على قراءة المخطوطة بشكل نقدي ، وجيفري إسترادا وفيلما دياز على دعمهم المستمر. تم دعم هذا العمل من خلال ملحق التنوع لمنحة المعاهد الوطنية للصحة GM136250.
Materials
| Alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6074 | primary antibody (1:5,000) |
| Axio Observer Inverted Microscope | Zeiss | na | microscope |
| Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12% | Invitrogen | NW04127BOX | Western Blot |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | nucleotide analogue |
| BrdU antibody BU1/75 | Abcam | ab6326 | primary antibody (1:500) |
| CellAdhere Dilution Buffer | Stemcell Technologies | 07183 | coating reagent |
| Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits | Invitrogen | C10632 | flow cytomery |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10640 | click-reaction kit |
| cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 5892791001 | reagent |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX2000 | cell counter |
| Coverslip | neuVitro | GG12PRE | tissue culture |
| Cyclin A2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-271682 | primary antibody (1:1,000) for IF and WB |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | primary antibody (1:5,000) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | vehicle control |
| DMEM, high glucose, with HEPES | Gibco | 12430051 | cell culture medium for RPE cells |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | the PBS used throughout the protocol |
| D-Sucrose | Thermo Fisher Scientific | bp220-1 | reagent |
| Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope | Nikon | na | microscope |
| EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) | Thermo Fisher Scientific | C10637 | nucleotide analog |
| Falcon 24-well plate | Corning | 351147 | tissue culture |
| Falcon Cell Culture Dishes 100 mm | Corning | 353003 | tissue culture |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 16140071 | media supplement |
| Fiji (ImageJ) | NIH | version 1.54f | software and algorithms |
| FxCycle PI/RNase Staining Solution | Invitrogen | F10797 | PI staining |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | secondary antibody (1:1,000) |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A48262 | secondary antibody (1:1,000) |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | primary antibody (1:10,000) |
| hTERT RPE1 | ATCC | CRL-3216 | cell line |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | reagent |
| Hydrogen peroxide 30% soultion | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | reagent |
| Hydroxyurea,98% powder | Sigma-Aldrich | H8627-5G | reagent |
| Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15-575-020 | reagent |
| Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | transfection reagent |
| Magnesium chloride solution 1 M | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | reagent |
| MycoFluor | Thermo Fisher | M7006 | Mycoplasma Detection Kit |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma-Aldrich | N9162-100UG | reagent |
| NuPage MES SDS Running Buffer (20x) | Invitrogen | NP0002 | Western Blot |
| onTARGETplus Human RPA2 siRNA | Dharmacon | L-017058-01-0005 | siRNA |
| p27 antibody | BD Biosciences | 610241 | primary antibody (1:1,000) |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | 50-980-494 | fixative |
| PARP1 antibody | Cell Signaling Technology | 9542S | primary antibody (1:1,000) |
| PCNA antibody | Cell Signaling Technology | 13110S | primary antibody (1:2,000) |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | media supplement |
| pH3 antibody | Cell Signaling Technology | 3377S | primary antibody (1:2,000) |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 4906837001 | reagent |
| PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0 | Bioworld | 41620034-1 | reagent |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610395 | Western Blot |
| Prism | GraphPad | version 10 | statistical analysis and graph |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | mounting media |
| Reduced serum media (Opti-MEM) | Gibco | 31985070 | used for transfection |
| Rpa32/rpa2 antibody (mouse) | EMD Millipore | NA19L | primary antibody (1:1,000) for WB |
| Rpa32/rpa2 antibody (rat) | Cell Signaling Technology | 2208S | primary antibody (1:1,000) for IF |
| Sodium Chloride solution (5 M) | Sigma-Aldrich | S5150 | reagent |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | media supplement |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | B3535-500G | reagent |
| Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain | Thermo Scientific | 62248 | nucleic acid stain |
| Thymidine,powder | Sigma-Aldrich | T1985-1G | reagent |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | detergent |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 1540054 | cell dissociation agent |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 07180 | coating reagent |
| ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad | na | flow cytomery |
References
- Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and ugly. EMBO J. 27 (4), 589-605 (2008).
- Gutierrez, R., O’Connor, T. R. DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance. Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).
- Krokan, H. E., Bjoras, M. Base excision repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583 (2013).
- Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).
- Li, G. M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 18 (1), 85-98 (2008).
- Hustedt, N., Durocher, D. The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol. 19 (1), 1-9 (2016).
- Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
- Bhat, D. S., et al. Therapeutic disruption of RAD52-ssDNA complexation via novel drug-like inhibitors. NAR Cancer. 5 (2), zcad018 (2023).
- Gupta, P., Saha, B., Chattopadhyay, S., Patro, B. S. Pharmacological targeting of differential DNA repair, radio-sensitizes WRN-deficient cancer cells in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 186, 114450 (2021).
- Pena-Diaz, J., et al. Noncanonical mismatch repair as a source of genomic instability in human cells. Mol Cell. 47 (5), 669-680 (2012).
- Schroering, A. G., Edelbrock, M. A., Richards, T. J., Williams, K. J. The cell cycle and DNA mismatch repair. Exp Cell Res. 313 (2), 292-304 (2007).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Genschel, J., Modrich, P. Mechanism of 5′-directed excision in human mismatch repair. Mol Cell. 12 (5), 1077-1086 (2003).
- Hu, J., et al. Nucleotide excision repair in human cells: fate of the excised oligonucleotide carrying DNA damage in vivo. J Biol Chem. 288 (29), 20918-20926 (2013).
- Huertas, P., Jackson, S. P. Human CtIP mediates cell cycle control of DNA end resection and double strand break repair. J Biol Chem. 284 (14), 9558-9565 (2009).
- Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in DNA replication with putative roles in cancer. Int J Mol Sci. 20 (1), 74 (2018).
- Symington, L. S. End resection at double-strand breaks: mechanism and regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (8), a016436 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair. J Biol Chem. 280 (5), 3665-3674 (2005).
- Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
- Wienholz, F., Vermeulen, W., Marteijn, J. A. Amplification of unscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cell quantification of transcription-coupled nucleotide excision repair. Nucleic Acids Res. 45 (9), e68 (2017).
- Wold, M. S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: single-stranded DNA’s first responder: dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. Bioessays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Kang, Y., et al. Alteration of replication protein A binding mode on single-stranded DNA by NSMF potentiates RPA phosphorylation by ATR kinase. Nucleic Acids Res. 51 (15), 7936-7950 (2023).
- Kilgas, S., Kiltie, A. E., Ramadan, K. Immunofluorescence microscopy-based detection of ssDNA foci by BrdU in mammalian cells. STAR Protoc. 2 (4), 100978 (2021).
- Madabhushi, R., Pan, L., Tsai, L. H. DNA damage and its links to neurodegeneration. Neuron. 83 (2), 266-282 (2014).
- Liboska, R., Ligasova, A., Strunin, D., Rosenberg, I., Koberna, K. Most anti-BrdU antibodies react with 2′-deoxy-5-ethynyluridine — the method for the effective suppression of this cross-reactivity. PLoS One. 7 (12), e51679 (2012).
- Biehs, R., et al. DNA double-strand break resection occurs during non-homologous end joining in G1 but is distinct from resection during homologous recombination. Mol Cell. 65 (4), 671-684.e5 (2017).
- Cruz-Garcia, A., Lopez-Saavedra, A., Huertas, P. BRCA1 accelerates CtIP-mediated DNA-end resection. Cell Rep. 9 (2), 451-459 (2014).
- Ercilla, A., et al. Physiological tolerance to ssDNA enables strand uncoupling during DNA replication. Cell Rep. 30 (7), 2416-2429.e7 (2020).
- Lezaja, A., et al. RPA shields inherited DNA lesions for post-mitotic DNA synthesis. Nat Commun. 12 (1), 3827 (2021).
- Mukherjee, B., Tomimatsu, N., Burma, S. Immunofluorescence-based methods to monitor DNA end resection. Methods Mol Biol. 1292, 67-75 (2015).
- Ochs, F., et al. 53BP1 fosters fidelity of homology-directed DNA repair. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 714-721 (2016).
- Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 1921-1926 (1999).
- Forment, J. V., Walker, R. V., Jackson, S. P. A high-throughput, flow cytometry-based method to quantify DNA-end resection in mammalian cells. Cytometry A. 81 (10), 922-928 (2012).
- Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Sci Rep. 6, 19567 (2016).
- Aten, J. A., Bakker, P. J., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. Histochem J. 24 (5), 251-259 (1992).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-phase labeling of dividing stem cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. Cell proliferation method: click chemistry based on BrdU coupling for multiplex antibody staining. Curr Protoc Cytom. Chapter 7, (2008).
- Ligasova, A., Koberna, K. Strengths and weaknesses of cell synchronization protocols based on inhibition of DNA synthesis. Int J Mol Sci. 22 (19), 10759 (2021).
