软脑膜淋巴内皮细胞 (LEC) 是一种最近发现的颅内细胞类型,其功能知之甚少。本研究提出了一种可重复的方案,用于从小鼠收获 LLEC 并建立 体外 原代培养物。该协议旨在使研究人员能够深入研究 LEC 的细胞功能和潜在临床意义。
软脑膜淋巴内皮细胞 (LEC) 是最近发现的颅内细胞群,具有与外周淋巴内皮细胞明显不同的独特分布。它们的细胞功能和临床意义在很大程度上仍然未知。因此,LLEC供应的可用性对于进行体外功能研究至关重要。然而,目前尚无现成的 体外收获和培养 LEC 的方案。
本研究使用多步骤方案成功收获了 LEC,其中包括用纤连蛋白包被烧瓶、在显微镜的帮助下解剖软脑膜、酶促消化软脑膜以制备单细胞悬浮液、用血管内皮生长因子-C (VEGF-C) 诱导 LLEC 扩增,以及通过磁活化细胞分选 (MACS) 选择淋巴管透明质酸受体-1 (LYVE-1) 阳性细胞。这个过程最终导致了一种主要文化的建立。通过免疫荧光染色和流式细胞术分析确认了LLECs的纯度,纯度超过95%。该多步方案已证明具有可重复性和可行性,这将极大地促进探索LLEC的细胞功能和临床意义。
新发现的软脑膜淋巴内皮细胞 (LEC) 在软脑膜内形成单个细胞的网状结构,与外周淋巴内皮细胞相比,表现出不同的分布模式 1,2。与LLEC相关的细胞功能和临床意义在很大程度上仍然是未知的领域。为了为LLEC的功能研究铺平道路,必须建立体外模型进行研究。因此,本研究设计了一种用于 LEC 分离和原代培养的综合方案。
小鼠是首选的动物模型,因为它们适合在疾病研究中进行基因操作。先前的研究已成功从各种小鼠组织中分离出淋巴内皮细胞,包括淋巴结3、肠系膜组织4、真皮组织5、收集淋巴管6 和肺组织7。这些分离程序主要依赖于磁活化细胞分选 (MACS) 和流式细胞术分选等技术 8,9,10。此外,研究工作还导致了大鼠蛛网膜细胞系和大鼠淋巴毛细血管细胞系的建立11,12。尽管存在针对软脑膜13 的外植体培养技术,但迫切需要一种标准化的方案来分离和培养 LLECs。因此,本研究通过在显微镜引导下细致地解离软脑膜,并通过使用血管内皮生长因子-C(VEGF-C)促进LLECs扩增,成功地收获和培养了LEC。淋巴内皮细胞的独特标志物是淋巴管透明质酸受体-1 (LYVE-1)14。该多步骤方案使用 MACS 选择性分离 LYVE-1 阳性 LEC,随后通过流式细胞术分析和免疫荧光染色验证其纯度。
该多步骤方案的主要步骤可以总结如下:烧瓶包被、软脑膜解离、软脑膜酶消化、细胞扩增、磁性细胞选择和随后的 LEC 培养。最后,通过流式细胞术分析和免疫荧光染色确认分离的LLECs的纯度。本研究的总体目标是提出一种可重复的多步骤方案,用于从小鼠软脑膜及其随后 的体外 培养中分离 LLEC。该协议有望极大地促进对 LEC 的细胞功能和临床意义的研究。
以前没有报道过在 体外 收获和培养LLEC的现有方案。本研究介绍了一种可重复的多程序方案,用于从小鼠软脑膜中收获和培养 LEC。
虽然这种多程序方案是可重复的,但有几个关键考虑因素。例如,纤连蛋白包被的 T25 烧瓶通过消除非贴壁细胞来促进 LEC 的粘附和功能,从而确保更均匀的细胞群。此外,解离软脑膜的手术过程的持续时间和温度是影响细胞活力的关键因素…
The authors have nothing to disclose.
该研究得到了国家自然科学基金(81960226,81760223)、云南省自然科学基金(202001AS070045,202301AY070001-011)和云南省教育厅科研基金(2023Y0784)的资助。
Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |