קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal
Summary
תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.
Abstract
תאי אנדותל לימפטיים לפטומנינגיאליים (LLECs) הם אוכלוסיית תאים תוך-גולגולתיים שהתגלתה לאחרונה עם תפוצה ייחודית הנבדלת בבירור מתאי אנדותל לימפטיים היקפיים. תפקודם התאי והשלכותיהם הקליניות עדיין אינם ידועים במידה רבה. כתוצאה מכך, הזמינות של אספקת LLECs חיונית לביצוע מחקר פונקציונלי במבחנה. עם זאת, אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול LLECs במבחנה.
מחקר זה אסף בהצלחה LLECs באמצעות פרוטוקול רב-שלבי, שכלל ציפוי הבקבוק בפיברונקטין (FIBRONECTIN), ניתוח הלפטומנינגים בעזרת מיקרוסקופ, עיכול אנזימטי של הלפטומנינגים כדי להכין תרחיף חד-תאי, גרימת התרחבות של LLECs עם גורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C), ובחירת תאים חיוביים קולטן היאלורוני של כלי הלימפה -1 (LYVE-1) באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). תהליך זה הוביל בסופו של דבר לכינונה של תרבות ראשונית. טוהר ה- LLECs אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח ציטומטרי זרימה, עם רמת טוהר העולה על 95%. פרוטוקול רב-שלבי זה הוכיח יכולת שחזור והיתכנות, אשר יקלו מאוד על חקר התפקוד התאי וההשלכות הקליניות של LLECs.
Introduction
תאי אנדותל לימפה לפטומנינגיאליים שהתגלו לאחרונה (LLECs) יוצרים רשת של תאים בודדים בתוך הלפטומנינגים, ומציגים דפוס התפלגות מובהק בהשוואה לתאי אנדותל לימפטיים היקפיים 1,2. התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות הקשורות ל-LLECs נותרו במידה רבה טריטוריה לא ממופת. על מנת לסלול את הדרך למחקר פונקציונלי על LLECs, הכרחי להקים מודל in vitro עבור המחקר שלהם. לכן, מחקר זה פיתח פרוטוקול מקיף לבידוד ותרבות ראשונית של LLECs.
עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל התאמתם למניפולציה גנטית בחקר מחלות. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה תאי אנדותל לימפטיים מרקמות עכבר שונות, כולל בלוטות לימפה3, רקמה מזנטרית4, רקמת עור5, איסוף לימפה6 ורקמת ריאה7. הליכי בידוד אלה הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) ומיון ציטומטריית זרימה 8,9,10. בנוסף, מאמצי המחקר הובילו להקמת קווי תאים ארכנואידים של חולדות וקווי תאי נימים לימפטיים של חולדות11,12. למרות קיומן של טכניקות תרבית צמחים עבור לפטומנינגה13, קיים צורך דחוף בפרוטוקול סטנדרטי לבידוד ותרבית של LLECs. כתוצאה מכך, מחקר זה הצליח לקצור ולתרבת LLECs על ידי ניתוק קפדני של לפטומנינגים בהנחיית מיקרוסקופ וקידום הרחבת LLECs באמצעות שימוש בגורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C). הסמן הייחודי לתאי אנדותל לימפטיים הוא קולטן היאלורוני של כלי הלימפה-1 (LYVE-1)14. פרוטוקול רב-שלבי זה מבודד באופן סלקטיבי LLECs חיוביים ל-LYVE-1 באמצעות MACS ולאחר מכן מוודא את טוהרם באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
ניתן לסכם את השלבים העיקריים של פרוטוקול רב-שלבי זה באופן הבא: ציפוי בקבוקים, דיסוציאציה של לפטומנינגים, עיכול אנזימטי של לפטומנינגים, התפשטות תאים, בחירת תאים מגנטיים ותרבית עוקבת של LLECs. לבסוף, טוהר ה- LLECs המבודדים מאושר באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית. מטרת העל של מחקר זה היא להציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לבידוד LLECs מלפטומינינגים של עכברים ומתרבית המבחנה שבאה בעקבותיהם. פרוטוקול זה צפוי להקל מאוד על חקירת התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות של LLECs.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הקיים לקציר וגידול LLECs במבחנה לא דווח בעבר. מחקר זה מציג פרוטוקול רב-פרוצדורלי הניתן לשחזור לקציר וגידול LLECs מלפטומינינגים של עכברים.
בעוד פרוטוקול רב-פרוצדורלי זה ניתן לשחזור, ישנם מספר שיקולים מרכזיים. לדוגמה, צלוחיות T25 מצופות פיברונקטין מקדמות הידבקות של L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226, 81760223), הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045, 202301AY070001-011), וקרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
