Oogst en primaire kweek van leptomeningeale lymfatische endotheelcellen
Summary
Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC’s), een recent geïdentificeerd intracraniaal celtype, hebben slecht begrepen functies. Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het oogsten van LLC’s van muizen en het opzetten van in vitro primaire culturen. Dit protocol is ontworpen om onderzoekers in staat te stellen zich te verdiepen in de cellulaire functies en mogelijke klinische implicaties van LLC’s.
Abstract
Leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC’s) zijn een recent ontdekte intracraniële cellulaire populatie met een unieke verdeling die duidelijk verschilt van perifere lymfatische endotheelcellen. Hun cellulaire functie en klinische implicaties blijven grotendeels onbekend. Bijgevolg is de beschikbaarheid van een aanbod van LLC’s van essentieel belang voor het uitvoeren van functioneel onderzoek in vitro. Er bestaat momenteel echter geen protocol voor het oogsten en kweken van LLC’s in vitro.
Deze studie oogstte met succes LLC’s met behulp van een meerstappenprotocol, waaronder het coaten van de kolf met fibronectine, het ontleden van de leptomeninges met behulp van een microscoop, het enzymatisch verteren van de leptomeninges om een eencellige suspensie te bereiden, het induceren van de expansie van LLC’s met vasculaire endotheliale groeifactor-C (VEGF-C) en het selecteren van hyaluronreceptor-1 (LYVE-1) positieve cellen van lymfevaten door middel van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). Dit proces leidde uiteindelijk tot de oprichting van een primaire cultuur. De zuiverheid van de LLC’s werd bevestigd door middel van immunofluorescentiekleuring en flowcytometrische analyse, met een zuiverheidsgraad van meer dan 95%. Dit meerstappenprotocol heeft reproduceerbaarheid en haalbaarheid aangetoond, wat de verkenning van de cellulaire functie en klinische implicaties van LLC’s aanzienlijk zal vergemakkelijken.
Introduction
De nieuw ontdekte leptomeningeale lymfatische endotheelcellen (LLC’s) vormen een netwerk van individuele cellen in de leptomeninges en vertonen een duidelijk distributiepatroon in vergelijking met perifere lymfatische endotheelcellen 1,2. De cellulaire functies en klinische implicaties die verband houden met LLC’s blijven grotendeels onbekend terrein. Om de weg vrij te maken voor functioneel onderzoek naar LLC’s, is het absoluut noodzakelijk om een in vitro model voor hun studie op te stellen. Daarom heeft deze studie een uitgebreid protocol opgesteld voor de isolatie en primaire cultuur van LLC’s.
Muizen hebben de voorkeur vanwege hun geschiktheid voor genetische manipulatie in ziekteonderzoek. Eerdere studies hebben met succes lymfatische endotheelcellen geïsoleerd uit verschillende muizenweefsels, waaronder lymfeklieren3, mesenteriaal weefsel4, huidweefsel5, verzamelende lymfevaten6 en longweefsel7. Deze isolatieprocedures zijn voornamelijk gebaseerd op technieken zoals magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) en flowcytometriesortering 8,9,10. Bovendien hebben onderzoeksinspanningen geleid tot de oprichting van arachnoïdale cellijnen van ratten en lymfatische capillaire cellijnen van ratten11,12. Ondanks het bestaan van explantatiekweektechnieken voor leptomeninges13 bestaat er dringend behoefte aan een gestandaardiseerd protocol voor de isolatie en kweek van LLC’s. Bijgevolg heeft deze studie met succes LLC’s geoogst en gekweekt door leptomeningen nauwgezet te dissociëren onder begeleiding van een microscoop en de uitbreiding van LLC’s te bevorderen door het gebruik van vasculaire endotheliale groeifactor-C (VEGF-C). De onderscheidende marker voor lymfatische endotheelcellen is hyaluronreceptor-1 (LYVE-1)14 van het lymfevat. Dit meerstapsprotocol isoleert selectief LYVE-1-positieve LLC’s met behulp van MACS en verifieert vervolgens hun zuiverheid door middel van flowcytometrische analyse en immunofluorescerende kleuring.
De primaire stappen van dit meerstappenprotocol kunnen als volgt worden samengevat: kolfcoating, dissociatie van leptomeningen, enzymatische vertering van leptomeningen, celexpansie, magnetische celselectie en daaropvolgende kweek van LLC’s. Ten slotte wordt de zuiverheid van de geïsoleerde LLC’s bevestigd door middel van flowcytometrische analyse en immunofluorescerende kleuring. Het overkoepelende doel van deze studie is het presenteren van een reproduceerbaar, meerstapsprotocol voor de isolatie van LLC’s uit leptomeninges van muizen en hun daaropvolgende in vitro kweek. Dit protocol is klaar om het onderzoek naar de cellulaire functies en klinische implicaties van LLC’s aanzienlijk te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bestaande protocol voor het oogsten en kweken van LLC’s in vitro is niet eerder gerapporteerd. Deze studie introduceert een reproduceerbaar, multiprocedureel protocol voor het oogsten en kweken van LLC’s uit leptomeninges van muizen.
Hoewel dit multiprocedurele protocol reproduceerbaar is, zijn er verschillende belangrijke overwegingen. Met fibronectine gecoate T25-kolven bevorderen bijvoorbeeld de hechting van LLC’s en functioneren door niet-hechtende cellen te elimineren, waardo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), de Natural Science Foundation van de provincie Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) en de Scientific Research Foundation van het ministerie van Onderwijs van de provincie Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
