Summary

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Published: September 08, 2023
doi:

Summary

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.

Abstract

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono una popolazione cellulare intracranica scoperta di recente con una distribuzione unica chiaramente distinta dalle cellule endoteliali linfatiche periferiche. La loro funzione cellulare e le implicazioni cliniche rimangono in gran parte sconosciute. Di conseguenza, la disponibilità di una fornitura di LLEC è essenziale per condurre ricerche funzionali in vitro. Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro.

Questo studio ha raccolto con successo le LLEC utilizzando un protocollo a più fasi, che includeva il rivestimento del pallone con fibronectina, la dissezione delle leptomeningi con l’assistenza di un microscopio, la digestione enzimatica delle leptomeningi per preparare una sospensione a singola cellula, l’induzione dell’espansione delle LLEC con il fattore di crescita dell’endotelio vascolare-C (VEGF-C) e la selezione di cellule positive al recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1) attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo processo ha portato alla creazione di una cultura primaria. La purezza degli LLEC è stata confermata attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l’analisi citofluorimetrica, con un livello di purezza superiore al 95%. Questo protocollo in più fasi ha dimostrato riproducibilità e fattibilità, il che faciliterà notevolmente l’esplorazione della funzione cellulare e delle implicazioni cliniche delle LLEC.

Introduction

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) appena scoperte formano un reticolo di singole cellule all’interno delle leptomeningi, mostrando un modello di distribuzione distinto rispetto alle cellule endoteliali linfatiche periferiche 1,2. Le funzioni cellulari e le implicazioni cliniche associate alle LLEC rimangono in gran parte un territorio inesplorato. Al fine di aprire la strada alla ricerca funzionale sui LLEC, è imperativo stabilire un modello in vitro per il loro studio. Pertanto, questo studio ha ideato un protocollo completo per l’isolamento e la coltura primaria delle LLEC.

I topi sono il modello animale preferito per la loro idoneità alla manipolazione genetica nella ricerca sulle malattie. Studi precedenti hanno isolato con successo cellule endoteliali linfatiche da vari tessuti di topo, tra cui i linfonodi3, il tessuto mesenterico4, il tessuto dermico5, i linfatici di raccolta6 e il tessuto polmonare7. Queste procedure di isolamento si sono basate principalmente su tecniche come il cernimento cellulare attivato magneticamente (MACS) e lo smistamento con citometria a flusso 8,9,10. Inoltre, gli sforzi di ricerca hanno portato alla creazione di linee cellulari aracnoidee di ratto e linee cellulari capillari linfatiche di ratto11,12. Nonostante l’esistenza di tecniche di coltura di espianto per leptomeningi13, esiste un urgente bisogno di un protocollo standardizzato per l’isolamento e la coltura delle LLEC. Di conseguenza, questo studio ha raccolto e coltivato con successo le LLEC dissociando meticolosamente le leptomeningi sotto la guida di un microscopio e promuovendo l’espansione delle LLEC attraverso l’uso del fattore di crescita dell’endotelio vascolare-C (VEGF-C). Il marcatore distintivo per le cellule endoteliali linfatiche è il recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1)14. Questo protocollo a più fasi isola selettivamente gli LLEC positivi a LYVE-1 utilizzando MACS e successivamente ne verifica la purezza attraverso l’analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente.

Le fasi principali di questo protocollo multi-step possono essere riassunte come segue: rivestimento del pallone, dissociazione delle leptomeningi, digestione enzimatica delle leptomeningi, espansione cellulare, selezione magnetica delle cellule e successiva coltura di LLEC. Infine, la purezza delle LLEC isolate è confermata attraverso l’analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente. L’obiettivo generale di questo studio è quello di presentare un protocollo riproducibile e multi-step per l’isolamento di LLEC da leptomeningi di topo e la loro successiva coltura in vitro . Questo protocollo è destinato a facilitare notevolmente le indagini sulle funzioni cellulari e sulle implicazioni cliniche delle LLEC.

Protocol

Questa ricerca ha ricevuto l’approvazione del Comitato Etico per gli Esperimenti Animali dell’Università di Medicina di Kunming (kmmu20220945). Tutti gli esperimenti hanno aderito alle linee guida stabilite per la cura degli animali. Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono state raccolte da topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane e di peso compreso tra 20 e 25 g. Questi topi sono stati acquistati dalla Kunming Medical University di Kunming, in Cina. L’intera procedura sperimentale ?…

Representative Results

Questo studio presenta un protocollo riproducibile in più fasi per la raccolta di cellule endoteliali linfatiche (LLEC) dai topi e successivamente la creazione della loro coltura primaria in vitro. Le fasi chiave riguardano la preparazione del matraccio e il rivestimento della fibronectina, la dissociazione delle leptomeningi, l’ottenimento di una sospensione unicellulare attraverso la digestione enzimatica e l’induzione dell’espansione delle LLEC con VEGF-C. Le LLEC LYVE-1-positive vengono quindi isolate selet…

Discussion

Il protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro non è stato precedentemente riportato. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multiprocedurale per la raccolta e la coltura di LLEC da leptomeningi di topo.

Sebbene questo protocollo multiprocedurale sia riproducibile, ci sono diverse considerazioni chiave. Ad esempio, i palloni T25 rivestiti di fibronectina promuovono l’adesione delle LLEC e funzionano eliminando le cellule non aderenti, garantendo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), della Natural Science Foundation della provincia dello Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) e della Scientific Research Foundation del Dipartimento dell’Istruzione della provincia dello Yunnan (2023Y0784).

Materials

Block buffer Beyotime P0102 Store aliquots at –4 °C
Collagenase I Solarbio C8140 Store aliquots at –20 °C
DAPI Beyotime P0131 Store aliquots at –20 °C
DMEM Solarbio 11995 Store aliquots at –4 °C
D-PBS Solarbio D1041 Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit Lonza C-3202 Store aliquots at –4 °C
FBS Solarbio S9010 Store aliquots at –20 °C
Fibronectin Solarbio F8180  Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software BD Biosciences V10.8.1
LYVE-1 antibody eBioscience 12-0443-82 Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator Miltenyi 130-042-302 Sterile before use
Magnetic separator stand Miltenyi 130-042-303 Sterile before use
Microbeads Miltenyi 130-048-801 Store aliquots at –4 °C
P/S Solarbio P1400 Store aliquots at –20 °C
Papain Solarbio G8430-25g Store aliquots at –20 °C
PBS Solarbio D1040 Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody Santa sc-53533 Store aliquots at –4 °C
PFA Solarbio P1110 Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody Santa sc-81983 Store aliquots at –4 °C
Selection column  Miltenyi 130-042-401 Sterile before use
Trypsin Gibco 25200072 Store aliquots at –20 °C
VEGF-C  Abcam ab51947 Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody Santa sc-514825 Store aliquots at –4 °C

References

  1. Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
  2. Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
  3. Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
  4. Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
  5. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  6. Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
  7. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  8. Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
  9. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  10. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
  11. Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
  12. Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
  13. Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
  14. Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
  15. Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
  16. Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
  17. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
  18. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
  19. Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
  20. Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
  21. DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
  22. Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
  23. Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
  24. Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).

Play Video

Cite This Article
Deng, H., Wu, K., Yu, H., Zhang, Y., Li, Y., Li, C., Wang, F. Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (199), e65872, doi:10.3791/65872 (2023).

View Video