Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen
Summary
Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.
Abstract
Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) sind eine kürzlich entdeckte intrakranielle Zellpopulation mit einer einzigartigen Verteilung, die sich deutlich von peripheren lymphatischen Endothelzellen unterscheidet. Ihre zelluläre Funktion und ihre klinischen Implikationen sind noch weitgehend unbekannt. Folglich ist die Verfügbarkeit eines Angebots an LLECs für die Durchführung funktioneller Forschung in vitro unerlässlich. Derzeit gibt es jedoch kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro.
In dieser Studie wurden LLECs erfolgreich mit einem mehrstufigen Protokoll geerntet, das die Beschichtung des Kolbens mit Fibronektin, die Präparation der Leptomeninge mit Hilfe eines Mikroskops, die enzymatische Verdauung der Leptomeninge zur Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Induktion der Expansion von LLECs mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-C (VEGF-C) und die Selektion von lymphatischen Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)-positiven Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) umfasste. Dieser Prozess führte schließlich zur Etablierung einer Primärkultur. Die Reinheit der LLECs wurde durch Immunfluoreszenzfärbung und durchflusszytometrische Analyse mit einem Reinheitsgrad von über 95 % bestätigt. Dieses mehrstufige Protokoll hat die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit unter Beweis gestellt, was die Erforschung der zellulären Funktion und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern wird.
Introduction
Die neu entdeckten leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen (LLECs) bilden ein Geflecht aus einzelnen Zellen innerhalb der Leptomeninge und weisen im Vergleich zu peripheren lymphatischen Endothelzellen ein deutliches Verteilungsmuster auf 1,2. Die zellulären Funktionen und klinischen Implikationen, die mit LLECs verbunden sind, sind nach wie vor weitgehend unbekanntes Terrain. Um den Weg für die funktionelle Forschung an LLECs zu ebnen, ist es zwingend erforderlich, ein In-vitro-Modell für ihre Untersuchung zu etablieren. Daher wurde in dieser Studie ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Primärkultur von LLECs entwickelt.
Mäuse sind aufgrund ihrer Eignung für die genetische Manipulation in der Krankheitsforschung das bevorzugte Tiermodell. Frühere Studien haben erfolgreich lymphatische Endothelzellen aus verschiedenen Mausgeweben isoliert, darunter Lymphknoten3, Mesenterialgewebe4, Hautgewebe5, sammelnde Lymphgefäße6 und Lungengewebe7. Diese Isolierungsverfahren beruhen in erster Linie auf Techniken wie der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) und der Durchflusszytometrie 8,9,10. Darüber hinaus haben die Forschungsbemühungen zur Etablierung von Arachnoidalzelllinien der Ratte und lymphatischen Kapillarzelllinien der Ratte geführt11,12. Trotz der Existenz von Explantatkulturtechniken für Leptomeninge13 besteht ein dringender Bedarf an einem standardisierten Protokoll für die Isolierung und Kultur von LLECs. Folglich wurden in dieser Studie erfolgreich LLECs geerntet und kultiviert, indem Leptomeninge unter Anleitung eines Mikroskops akribisch dissoziiert und die LLEC-Expansion durch den Einsatz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors-C (VEGF-C) gefördert wurden. Der charakteristische Marker für lymphatische Endothelzellen ist der lymphatische Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)14. Dieses mehrstufige Protokoll isoliert selektiv LYVE-1-positive LLECs mittels MACS und verifiziert anschließend ihre Reinheit durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung.
Die Hauptschritte dieses mehrstufigen Protokolls können wie folgt zusammengefasst werden: Kolbenbeschichtung, Dissoziation von Leptomeningen, enzymatischer Verdau von Leptomeningen, Zellexpansion, magnetische Zellselektion und anschließende Kultur von LLECs. Abschließend wird die Reinheit der isolierten LLECs durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Isolierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus und deren anschließende in vitro Kultur vorzustellen. Dieses Protokoll wird die Untersuchung der zellulären Funktionen und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Über das bestehende Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro wurde bisher nicht berichtet. In dieser Studie wird ein reproduzierbares, multiprozedurales Protokoll für die Gewinnung und Kultivierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus vorgestellt.
Obwohl dieses multiprozedurale Protokoll reproduzierbar ist, gibt es mehrere wichtige Überlegungen. Zum Beispiel fördern Fibronektin-beschichtete T25-Kolben die Adhäsion von LLECs und ihre Funktion, indem sie nicht a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), der Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AS070045, 202301AY070001-011) und der Scientific Research Foundation des Bildungsministeriums der Provinz Yunnan (2023Y0784) unterstützt.
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
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