Заготовка и первичная культура лептоменингеальных лимфатических эндотелиальных клеток
Summary
Лептоменингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (LLECs), недавно идентифицированный тип внутричерепных клеток, имеют плохо изученные функции. В этом исследовании представлен воспроизводимый протокол получения LLEC у мышей и создания первичных культур in vitro . Этот протокол предназначен для того, чтобы позволить исследователям углубиться в клеточные функции и потенциальные клинические последствия LLEC.
Abstract
Лептоменингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (ЛЛЕК) представляют собой недавно обнаруженную внутричерепную клеточную популяцию с уникальным распределением, четко отличающимся от периферических лимфатических эндотелиальных клеток. Их клеточная функция и клинические последствия остаются в значительной степени неизвестными. Следовательно, наличие запаса LLEC имеет важное значение для проведения функциональных исследований in vitro. Тем не менее, в настоящее время не существует протокола для сбора и культивирования LLEC in vitro.
В этом исследовании был успешно собран LLEC с использованием многоступенчатого протокола, который включал покрытие колбы фибронектином, рассечение лептоменингов с помощью микроскопа, ферментативное расщепление лептоменингов для получения одноклеточной суспензии, индуцирование экспансии LLEC с фактором роста эндотелия сосудов-С (VEGF-C) и отбор положительных клеток гиалуронового рецептора-1 лимфатических сосудов (LYVE-1) с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Этот процесс в конечном итоге привел к формированию первичной культуры. Чистота ЛЛЭК подтверждена методом иммунофлуоресцентного окрашивания и проточного цитометрического анализа, при этом уровень чистоты превысил 95%. Этот многоступенчатый протокол продемонстрировал воспроизводимость и осуществимость, что значительно облегчит изучение клеточной функции и клинических последствий LLEC.
Introduction
Недавно обнаруженные лептоменингеальные лимфатические эндотелиальные клетки (ЛЛЕК) образуют сетку из отдельных клеток в лептоменингах, демонстрируя отчетливую картину распределения по сравнению с периферическими лимфатическими эндотелиальными клетками 1,2. Клеточные функции и клинические последствия, связанные с LLEC, остаются в значительной степени неизведанной территорией. Для того, чтобы проложить путь для функциональных исследований LLEC, необходимо создать модель in vitro для их изучения. Таким образом, в этом исследовании был разработан комплексный протокол для изоляции и первичной культуры LLEC.
Мыши являются предпочтительной животной моделью из-за их пригодности для генетических манипуляций при исследовании заболеваний. В предыдущих исследованиях были успешно выделены лимфатические эндотелиальные клетки из различных тканей мышей, включая лимфатические узлы3, брыжеечную ткань4, дермальную ткань5, собирающие лимфатические элементы6 и легочную ткань7. Эти процедуры выделения в основном основывались на таких методах, как магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) и сортировка методом проточной цитометрии 8,9,10. Кроме того, исследовательские усилия привели к созданию линий арахноидальных клеток крыс и лимфатических капиллярных клеточных линийкрыс 11,12. Несмотря на существование методов культивирования эксплантов для лептоменингов13, существует острая необходимость в стандартизированном протоколе для выделения и культивирования ЛЛЭК. Следовательно, в этом исследовании был успешно собран и культивирован LLEC путем тщательной диссоциации лептоменингов под контролем микроскопа и стимулирования экспансии LLEC с помощью фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-C). Отличительным маркером лимфатических эндотелиальных клеток является гиалуроновый рецептор-1 лимфатического сосуда (LYVE-1)14. Этот многоступенчатый протокол селективно изолирует LYVE-1-положительные LLEC с помощью MACS и впоследствии проверяет их чистоту с помощью проточного цитометрического анализа и иммунофлуоресцентного окрашивания.
Основные этапы этого многоэтапного протокола можно резюмировать следующим образом: покрытие колбы, диссоциация лептоменингов, ферментативное расщепление лептоменингов, клеточная экспансия, магнитный отбор клеток и последующее культивирование LLEC. Наконец, чистота выделенных ЛЛЕК подтверждается с помощью проточного цитометрического анализа и иммунофлуоресцентного окрашивания. Основная цель данного исследования состоит в том, чтобы представить воспроизводимый многоступенчатый протокол выделения LLEC из мышиных лептоменингов и их последующего культивирования in vitro . Этот протокол призван значительно облегчить исследования клеточных функций и клинических последствий LLECs.
Protocol
Representative Results
Discussion
О существующем протоколе сбора и культивирования LLEC in vitro ранее не сообщалось. В этом исследовании представлен воспроизводимый, многопроцедурный протокол сбора и культивирования LLEC из лептоменингов мышей.
Несмотря на то, что этот многопроцедурный протокол воспрои?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (81960226, 81760223), Фонда естественных наук провинции Юньнань (202001AS070045, 202301AY070001-011) и Научно-исследовательского фонда Департамента образования провинции Юньнань (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
