核酸比の迅速な探索のための最適化されたマウス胚性幹細胞ベースのリバースポリトランスフェクション技術(英語)

哺乳類細胞へのDNAとRNAの送達は、生物医学研究の中核的な柱として機能します¹。外因性核酸(NA)を哺乳類細胞に導入する一般的な方法は、一過性トランスフェクション^2,3です。この技術は、NAをレシピエント細胞に送達できる市販のトランスフェクション試薬と混合することに依存しています。通常、NAはフォワードトランスフェクションを介して送達され、2次元表面に接着した細胞がトランスフェクション複合体を受け取ります。最も一般的な確立された細胞株のフォワードトランスフェクションは頑健であり、プロトコルは十分に公開されていますが、非単層形態のよりニッチな細胞タイプではトランスフェクションが容易ではなく、送達できるNAの量とそれを受け取る細胞の数が制限されます。

多能性幹細胞(PSC)は、無限に分裂し、あらゆる種類の体細胞を産生する能力があるため、発生を理解するための魅力的なモデルとして、また再生医療のツールとして機能します。マウスPSC(mPSC)の場合、2つの阻害剤とLIF(2i/LIF)を用いたルーチンのin vitro培養条件では、ドーム状のコロニー形態が維持され、フォワードトランスフェクションに曝露される細胞の数が直接制限されます^4,5,6。これに対処するために、接^着細胞にトランスフェクション試薬を添加するのではなく、培地とトランスフェクション試薬を含むディッシュに細胞を添加するリバーストランスフェクションを実施することができます7。これにより、試薬に曝露される細胞の数が増加しますが、細胞の継代とトランスフェクションを同時に行う必要もあります。

研究者は、単純な単一NAトランスフェクションを超えて、複数のNAコンストラクトをin vitroの細胞集団に導入することをしばしば目指します。これは典型的には、NAを所定の比率(1:1、9:1など)で混合し、次に選択したトランスフェクション^試薬と組み合わせるコトランスフェクションによって達成される8。これにより、NAと試薬の混合物が得られ、NAの元の比率が互いに維持されます – 処理中の細胞は、この混合物の異なる量を受け取る可能性がありますが、それらはすべて同じ比率^{を受け取ります}9。これは、部品の所望の比率がわかっている場合に有利ですが、この比率を事前に決定することは、各比率が異なる条件を構成するため、労働集約的になる可能性があります。1つの代替案は、個々のNAをトランスフェクション試薬と互いに独立して混合する「ポリトランスフェクション」を行うことである⁹。個々のNAを含むトランスフェクション複合体を組み合わせることにより(複合体を作成する前にNAを組み合わせるのではなく)、研究者は1回のトランスフェクション実験で幅広いNA化学量論を調べることができます⁹。これは、誘導可能な転写系や^1,10,11にフィードバックが組み込まれたシステムなど、複数のNAの産物が互いに相互作用することが予想される場合に特に価値があります。しかし、これを効果的に行うには、高いトランスフェクション効率が必要です。実際、トランスフェクションされた一意のNAの数が増加すると、特定の細胞が所望のNAのすべてを受け取る確率は指数^{関数的に減少し}ます^9,12。

以下の報告では、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いたmPS細胞のリバーストランスフェクションプロトコルについて説明しており、細胞を試薬とNAの混合物に最大5分間曝露することで、生存率を最大化し、通常の培養条件以外での時間を最小限に抑えます。このプロトコルをこれらの細胞の標準的な前方トランスフェクションと比較すると、トランスフェクション効率が高く、トランスフェクションされた細胞の総数が増加していることが実証されます。このリバーストランスフェクションを、単純な蛍光レポーターを用いた3プラスミドポリトランスフェクションと組み合わせることで、高いトランスフェクション効率でNA比をスクリーニングする可能性が広がります。