Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos
Summary
O presente protocolo descreve um método de politransfecção reversa de células-tronco embrionárias de camundongos durante o cultivo com meios 2i e LIP. Este método produz maior viabilidade e eficiência do que os protocolos tradicionais de transfecção direta, ao mesmo tempo em que permite a otimização one-pot das proporções plasmidiais.
Abstract
Devido à sua relativa simplicidade e facilidade de uso, a transfecção transitória de linhagens celulares de mamíferos com ácidos nucléicos tornou-se um pilar na pesquisa biomédica. Embora as linhagens celulares mais utilizadas possuam protocolos robustos para transfecção em cultura bidimensional aderente, esses protocolos muitas vezes não se traduzem bem para linhagens menos estudadas ou com morfologias atípicas e difíceis de transfectar. Usando células-tronco pluripotentes de camundongos cultivadas em meios 2i/LIF, um modelo de cultura amplamente utilizado para medicina regenerativa, este método delineia um protocolo de transfecção reversa rápido e otimizado capaz de alcançar maior eficiência de transfecção. Aproveitando este protocolo, uma politransfecção de três plasmídeos é realizada, aproveitando a eficiência maior do que o normal na entrega de plasmídeos para estudar uma gama expandida de estequiometria de plasmídeos. Este protocolo de politransfecção reversa permite um método experimental de um pote, permitindo que os usuários otimizem as proporções de plasmídeos em um único poço, em vez de em várias cotransfecções. Ao facilitar a rápida exploração do efeito da estequiometria do DNA na função global dos circuitos genéticos liberados, este protocolo minimiza o tempo e o custo da transfecção de células-tronco embrionárias.
Introduction
A entrega de DNA e RNA em células de mamíferos serve como um pilar central da pesquisa biomédica1. Um método comum para a introdução de ácidos nucléicos (NA) exógenos em células de mamíferos é por transfecção transitória 2,3. Essa técnica baseia-se na mistura de NA com reagentes de transfecção disponíveis comercialmente, capazes de entregá-los nas células receptoras. Normalmente, o NA é liberado via transfecção anterior, onde as células aderidas a uma superfície bidimensional recebem o complexo de transfecção. Enquanto a transfecção direta para as linhagens celulares estabelecidas mais comuns é robusta e os protocolos são bem publicados, tipos celulares de nicho com morfologias não monocamadas não transfectam facilmente, limitando a quantidade de NA que pode ser entregue e o número de células que o recebem.
As células-tronco pluripotentes (PSCs) servem como um modelo atraente para a compreensão do desenvolvimento e como uma ferramenta para a medicina regenerativa, dada sua capacidade de se dividir indefinidamente e produzir qualquer tipo de célula corporal. Para PSCs de camundongos (mPSCs), condições rotineiras de cultivo in vitro com 2 inibidores e LIF (2i/LIF) mantêm uma morfologia de colônia semelhante a uma cúpula, limitando diretamente o número de células expostas a uma transfecção anterior 4,5,6. Para resolver isso, uma transfecção reversa pode ser realizada: células são adicionadas a uma placa contendo meio e reagente de transfecção, em vez de adicionar reagente de transfecção às células aderentes7. Embora isso aumente o número de células expostas ao reagente, também requer que as células sejam passadas e transfectadas simultaneamente.
Indo além de simples transfecções de NA único, os pesquisadores geralmente visam entregar várias construções de NA em uma população de células in vitro. Isso é tipicamente conseguido através de uma co-transfecção, onde os NAs são misturados em uma determinada proporção (1:1, 9:1, etc.) e são então combinados com o reagente de transfecção escolhido8. Isso produz uma mistura de NAs e reagentes que preserva a proporção original de NAs entre si – enquanto as células em tratamento podem receber quantidades diferentes dessa mistura, todas recebem a mesma proporção9. Embora isso seja vantajoso quando a proporção desejada de partes é conhecida, determinar essa proporção antecipadamente pode ser trabalhoso, com cada razão constituindo uma condição diferente. Uma alternativa é realizar uma “politransfecção”, em que os AEs individuais são misturados com o reagente de transfecção independentemente uns dos outros9. Ao combinar complexos de transfecção contendo NAs individuais (em vez de combinar NAs antes de criar os complexos), os pesquisadores podem explorar uma ampla gama de estequiometrias de NA em um único experimento de transfecção9. Isso é particularmente valioso nos casos em que se espera que os produtos de vários NAs interajam entre si, como com sistemas de transcrição induzíveis ou sistemas com feedback embutido 1,10,11. No entanto, para fazê-lo de forma eficaz, uma alta eficiência de transfecção é necessária. De fato, à medida que o número de NAs únicos transfectados aumenta, a probabilidade de uma dada célula receber todos os NAs desejados diminui exponencialmente 9,12.
O relato a seguir descreve um protocolo de transfecção reversa para mPSCs usando um reagente de transfecção catiônico baseado em lipídios, no qual as células são expostas à mistura reagente-NA por no máximo 5 min para maximizar a viabilidade e minimizar o tempo fora das condições típicas de cultura. A comparação deste protocolo com a transfecção direta padrão dessas células demonstra uma maior eficiência de transfecção e um aumento no número total de células transfectadas sobreviventes. Combinando esta transfecção reversa com uma politransfecção de três plasmídeos envolvendo repórteres fluorescentes simples, um potencial expandido para rastrear razões de NA com alta eficiência de transfecção é demonstrado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma das principais razões para a ampla adoção de protocolos de transfecção é sua reprodutibilidade e acessibilidade; no entanto, esses protocolos requerem otimização em contextos experimentais. Não mencionado acima é o teste padrão exigido ao tentar transfectar uma nova linhagem celular pela primeira vez. Primeiro, a escolha do reagente de transfecção é fundamental, pois os reagentes comercialmente disponíveis não são únicos e variam na eficiência da viabilidade da entrega de NA entre os tipos celulare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer as muitas contribuições para a área que não foram citadas neste trabalho devido a limitações de espaço, bem como as agências de fomento que proporcionaram essa oportunidade. Os autores agradecem o financiamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), que apoiaram este trabalho. K.M. recebeu uma bolsa CGS-M do NSERC e uma bolsa de doutorado Killam da Universidade da Colúmbia Britânica. N.S. recebeu o Michael Smith Health Research BC Scholar Award.
Materials
| Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
| Apotransferrin | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Gibco | 15260-037 | |
| CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
| DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
| Flow cytometry standardization beads | Spherotech | URCP-38-2K | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G1890 | |
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin | Gibco | 12585-0014 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Neurobasal media | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
| Progesterone | MilliporeSigma | P8783 | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Putrescine | MilliporeSigma | P6780 | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Recombinant mLIF | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
| Sodium selenite | MilliporeSigma | S5261-25G | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
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