טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.
Abstract
בשל פשטותו היחסית וקלות השימוש בו, טרנספקציה חולפת של קווי תאי יונקים עם חומצות גרעין הפכה לעמוד התווך במחקר הביו-רפואי. בעוד שלרוב קווי התאים הנפוצים ביותר יש פרוטוקולים חזקים לטרנספקציה בתרבית דו-ממדית דבקה, פרוטוקולים אלה לעתים קרובות אינם מתורגמים היטב לקווים פחות נחקרים או לאלה עם מורפולוגיות לא טיפוסיות וקשות להעברה. באמצעות שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים של עכברים הגדלים במדיה 2i/LIF, מודל תרבית נפוץ לרפואה רגנרטיבית, שיטה זו מתווה פרוטוקול אופטימלי ומהיר של טרנספקציה הפוכה המסוגל להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. תוך מינוף פרוטוקול זה, מבוצעת פולי-טרנספקציה של שלושה פלסמידים, תוך ניצול היעילות הגבוהה מהרגיל במסירת פלסמיד כדי לחקור טווח מורחב של סטויכיומטריית פלסמיד. פרוטוקול פולי-טרנספקציה הפוך זה מאפשר שיטה ניסיונית של סיר אחד, המאפשר למשתמשים למטב את יחסי הפלסמיד בבאר אחת, במקום על פני מספר טרנספקציות משותפות. על ידי הקלת החקירה המהירה של ההשפעה של סטויכיומטריית DNA על התפקוד הכולל של מעגלים גנטיים מועברים, פרוטוקול זה ממזער את הזמן והעלות של טרנספקציה של תאי גזע עובריים.
Introduction
העברת דנ”א ורנ”א לתאי יונקים משמשת עמוד תווך מרכזי במחקר הביו-רפואי1. שיטה נפוצה להחדרת חומצות גרעין אקסוגניות (NA) לתאי יונקים היא באמצעות טרנספקציה חולפת 2,3. טכניקה זו מסתמכת על ערבוב NA עם ריאגנטים טרנספקציה זמינים מסחרית המסוגלים להעביר אותם לתוך התאים המקבלים. בדרך כלל, NA מועבר באמצעות טרנספקציה קדמית, שבה תאים הנצמדים למשטח דו-ממדי מקבלים את קומפלקס הטרנספקציה. בעוד שטרנספקציה קדימה עבור קווי התאים המבוססים הנפוצים ביותר היא חזקה והפרוטוקולים מפורסמים היטב, סוגי תאים נישתיים יותר עם מורפולוגיות לא חד-שכבתיות אינם עוברים בקלות, ומגבילים את כמות ה-NA שניתן להעביר ואת מספר התאים שמקבלים אותה.
תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) משמשים מודל אטרקטיבי להבנת ההתפתחות וככלי לרפואה רגנרטיבית, בהתחשב ביכולתם להתחלק ללא הגבלת זמן ולייצר כל סוג של תא גוף. עבור PSCs של עכברים (mPSCs), תנאי תרבית חוץ גופית שגרתיים עם 2 מעכבים ו-LIF (2i/LIF) שומרים על מורפולוגיה דמוית מושבה דמוית כיפה, ומגבילים ישירות את מספר התאים החשופים להתמרה קדמית 4,5,6. כדי לטפל בכך, ניתן לבצע טרנספקציה הפוכה: תאים מתווספים לצלחת המכילה מדיה ומגיב טרנספקציה, במקום להוסיף מגיב טרנספקציה לתאים דבקים7. בעוד שזה מגדיל את מספר התאים שנחשפו למגיב, זה גם דורש את התאים לעבור ולהדביק בו זמנית.
מעבר לטרנספקציות פשוטות של אנ-איי יחיד, חוקרים שואפים לעתים קרובות להעביר מספר מבנים של אנ-איי לאוכלוסיית תאים במבחנה. זה מושג בדרך כלל באמצעות טרנספקציה משותפת, שבה NAs מעורבבים ביחס נתון (1:1, 9:1, וכו ‘) ולאחר מכן משולבים עם מגיב transfection שנבחר8. זה מניב תערובת של NAs וריאגנט המשמר את היחס המקורי של NAs זה לזה – בעוד תאים בטיפול עשויים לקבל כמויות שונות של תערובת זו, כולם מקבלים את אותו יחס9. אמנם זה יתרון כאשר היחס הרצוי של חלקים ידוע, קביעת יחס זה מראש יכול להיות עבודה אינטנסיבית, כאשר כל יחס מהווה תנאי אחר. חלופה אחת היא לבצע “פולי-טרנספקציה”, שבה NAs בודדים מעורבבים עם מגיב הטרנספקציה בנפרד זה מזה9. על ידי שילוב קומפלקסים של טרנספקציה המכילים NAs בודדים (במקום שילוב NAs לפני יצירת המכלולים), חוקרים יכולים לחקור מגוון רחב של סטויכיומטריה של NA בניסוי טרנספקציה יחיד9. זה חשוב במיוחד במקרים שבהם המוצרים של מספר NAs צפויים לקיים אינטראקציה זה עם זה, כגון עם מערכות שעתוק אינדוקטיבי או מערכות עם משוב מובנה 1,10,11. עם זאת, כדי לעשות זאת ביעילות, נדרשת יעילות העברה גבוהה. ואכן, ככל שמספר ה-NAs הייחודיים הנגועים גדל, ההסתברות שתא נתון יקבל את כל ה-NAs הרצויים פוחתת באופן אקספוננציאלי 9,12.
הדו”ח הבא מתאר פרוטוקול טרנספקציה הפוכה עבור mPSCs באמצעות מגיב טרנספקציה קטיוני מבוסס שומנים, שבו תאים נחשפים לתערובת מגיב-NA למשך 5 דקות לכל היותר כדי למקסם את הכדאיות ולמזער את הזמן מחוץ לתנאי תרבית טיפוסיים. השוואת פרוטוקול זה לטרנספקציה הקדמית הסטנדרטית של תאים אלה מדגימה יעילות טרנספקציה גבוהה יותר ועלייה במספר הכולל של תאים נגועים ששרדו. על ידי שילוב של טרנספקציה הפוכה זו עם פולי-טרנספקציה תלת-פלסמידית הכוללת כתבים פלואורסצנטיים פשוטים, מודגם פוטנציאל מורחב לסינון יחסי NA עם יעילות טרנספקציה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
סיבה מרכזית לאימוץ הנרחב של פרוטוקולי טרנספקציה היא יכולת השחזור והנגישות שלהם; עם זאת, פרוטוקולים אלה דורשים אופטימיזציה על פני הקשרים ניסיוניים. לא הוזכרה לעיל הבדיקה הסטנדרטית הנדרשת כאשר מנסים לבצע טרנספורמציה של קו תאים חדש בפעם הראשונה. ראשית, הבחירה בריאגנטים טרנספקציה היא המפתח, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות על התרומות הרבות לתחום שלא צוינו בעבודה זו בשל מגבלות מקום, כמו גם על סוכנויות המימון שסיפקו הזדמנות זו. המחברים מודים על מימון ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ומהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), שתמכו בעבודה זו. ק.מ. זכה במלגת CGS-M מטעם NSERC ובמלגת קילאם לדוקטורט מאוניברסיטת קולומביה הבריטית. נ.ס. זכה בפרס Michael Smith Health Research BC Scholar Award.
Materials
| Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
| Apotransferrin | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Gibco | 15260-037 | |
| CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
| DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
| Flow cytometry standardization beads | Spherotech | URCP-38-2K | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G1890 | |
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin | Gibco | 12585-0014 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Neurobasal media | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
| Progesterone | MilliporeSigma | P8783 | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Putrescine | MilliporeSigma | P6780 | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Recombinant mLIF | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
| Sodium selenite | MilliporeSigma | S5261-25G | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
- FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).
- Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states. BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).
- Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), 173146 (2019).
- Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 11165 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A "poly-transfection" method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection. Journal of Visualized Experiments. (192), e64793 (2023).
- Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
- Teague, B. Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2023).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).
