Een geoptimaliseerde op embryonale stamcellen gebaseerde omgekeerde polytransfectietechniek voor snelle verkenning van nucleïnezuurverhoudingen

Levering van DNA en RNA aan zoogdiercellen dient als een kernpijler van biomedisch onderzoek¹. Een veelgebruikte methode voor het introduceren van exogene nucleïnezuren (NA) in zoogdiercellen is door middel van transiënte transfectie ^2,3. Deze techniek is gebaseerd op het mengen van NA met in de handel verkrijgbare transfectiereagentia die in staat zijn om ze in de ontvangende cellen af te leveren. Meestal wordt NA afgeleverd via voorwaartse transfectie, waarbij cellen die zich aan een tweedimensionaal oppervlak hechten, het transfectiecomplex ontvangen. Hoewel voorwaartse transfectie voor de meest voorkomende gevestigde cellijnen robuust is en protocollen goed zijn gepubliceerd, transfecteren meer nicheceltypen met niet-monolaagse morfologieën niet gemakkelijk, waardoor de hoeveelheid NA die kan worden afgeleverd en het aantal cellen dat het ontvangt, wordt beperkt.

Pluripotente stamcellen (PSC’s) dienen als een aantrekkelijk model voor het begrijpen van ontwikkeling en als een hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde, gezien hun vermogen om zich voor onbepaalde tijd te delen en elk lichaamsceltype te produceren. Voor PSC’s van muizen (mPSC’s) behouden routinematige in vitro kweekomstandigheden met 2 remmers en LIF (2i/LIF) een koepelachtige koloniemorfologie, waardoor het aantal cellen dat wordt blootgesteld aan een voorwaartse transfectie direct wordt beperkt ^4,5,6. Om dit aan te pakken, kan een omgekeerde transfectie worden uitgevoerd: cellen worden toegevoegd aan een schaal die media en transfectiereagens bevat, in plaats van transfectiereagens toe te voegen aan aanhangende cellen⁷. Hoewel dit het aantal cellen dat aan het reagens wordt blootgesteld, verhoogt, moeten de cellen ook gelijktijdig worden gepasseerd en getransfecteerd.

Onderzoekers gaan verder dan eenvoudige enkelvoudige NA-transfecties en streven er vaak naar om verschillende NA-constructen in vitro in een populatie cellen af te leveren. Dit wordt meestal bereikt door middel van een co-transfectie, waarbij de NA’s in een bepaalde verhouding (1:1, 9:1, enz.) worden gemengd en vervolgens worden gecombineerd met het gekozen transfectiereagens⁸. Dit levert een mix van NA’s en reagens op die de oorspronkelijke verhouding van NA’s tot elkaar behoudt – hoewel cellen in de behandeling verschillende hoeveelheden van deze mix kunnen krijgen, krijgen ze allemaal dezelfde verhouding⁹. Hoewel dit voordelig is wanneer de gewenste verhouding van onderdelen bekend is, kan het van tevoren bepalen van deze verhouding arbeidsintensief zijn, waarbij elke verhouding een andere voorwaarde vormt. Een alternatief is om een “poly-transfectie” uit te voeren, waarbij individuele NA’s onafhankelijk van elkaar worden gemengd met het transfectiereagens⁹. Door transfectiecomplexen te combineren die individuele NA’s bevatten (in plaats van NA’s te combineren voordat de complexen worden gemaakt), kunnen onderzoekers een breed scala aan NA-stoichiometrieën onderzoeken in een enkel transfectie-experiment⁹. Dit is met name waardevol in gevallen waarin van de producten van verschillende NA’s wordt verwacht dat ze met elkaar interageren, zoals met induceerbare transcriptiesystemen of systemen met ingebouwde feedback 1,10,11. Om dit effectief te doen, is echter een hoge transfectie-efficiëntie nodig. Naarmate het aantal unieke getransfecteerde NA’s toeneemt, neemt de kans dat een bepaalde cel alle gewenste NA’s ontvangt exponentieel af ^9,12.

Het volgende rapport beschrijft een omgekeerd transfectieprotocol voor mPSC’s met behulp van een op kationen gebaseerd transfectiereagens, waarbij cellen gedurende maximaal 5 minuten worden blootgesteld aan het reagens-NA-mengsel om de levensvatbaarheid te maximaliseren en de tijd buiten typische kweekomstandigheden te minimaliseren. Vergelijking van dit protocol met de standaard voorwaartse transfectie van deze cellen toont een hogere transfectie-efficiëntie en een toename van het totale aantal overlevende getransfecteerde cellen. Door deze omgekeerde transfectie te combineren met een drie-plasmide poly-transfectie met eenvoudige fluorescerende reporters, wordt een uitgebreid potentieel aangetoond om NA-ratio’s met een hoge transfectie-efficiëntie te screenen.