تقنية نقل عكسي عكسية قائمة على الخلايا الجذعية الجنينية للفأر للاستكشاف السريع لنسب الحمض النووي
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للنقل العكسي المتعدد للخلايا الجذعية الجنينية للفأر أثناء الزراعة باستخدام وسائط 2i و LIF. تنتج هذه الطريقة قابلية وكفاءة أعلى من بروتوكولات النقل الأمامية التقليدية ، مع تمكين تحسين نسب البلازميد في وعاء واحد.
Abstract
نظرا لبساطته النسبية وسهولة استخدامه ، أصبح النقل العابر لخطوط خلايا الثدييات بالأحماض النووية دعامة أساسية في البحوث الطبية الحيوية. في حين أن معظم خطوط الخلايا المستخدمة على نطاق واسع لديها بروتوكولات قوية للانتقال في ثقافة ثنائية الأبعاد ملتصقة ، فإن هذه البروتوكولات غالبا لا تترجم جيدا إلى خطوط أقل دراسة أو تلك التي تحتوي على أشكال غير نمطية يصعب نقلها. باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات للفأر المزروعة في وسائط 2i / LIF ، وهو نموذج استزراع يستخدم على نطاق واسع للطب التجديدي ، تحدد هذه الطريقة بروتوكول نقل عكسي محسن وسريع قادر على تحقيق كفاءة نقل أعلى. بالاستفادة من هذا البروتوكول ، يتم إجراء نقل متعدد ثلاثي البلازميد ، مع الاستفادة من الكفاءة الأعلى من المعتاد في توصيل البلازميد لدراسة نطاق موسع من القياس الكيميائي للبلازميد. يسمح بروتوكول النقل المتعدد العكسي هذا بطريقة تجريبية ذات وعاء واحد ، مما يمكن المستخدمين من تحسين نسب البلازميد في بئر واحد ، بدلا من العديد من عمليات النقل المشتركة. من خلال تسهيل الاستكشاف السريع لتأثير القياس الكيميائي للحمض النووي على الوظيفة العامة للدوائر الجينية المسلمة ، يقلل هذا البروتوكول من وقت وتكلفة نقل الخلايا الجذعية الجنينية.
Introduction
يعد توصيل الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى خلايا الثدييات بمثابة ركيزة أساسية للبحوث الطبية الحيوية1. طريقة شائعة لإدخال الأحماض النووية الخارجية (NA) في خلايا الثدييات هي من خلال النقل العابر 2,3. تعتمد هذه التقنية على خلط NA مع كواشف النقل المتاحة تجاريا القادرة على توصيلها إلى الخلايا المتلقية. عادة ، يتم تسليم NA عن طريق النقل الأمامي ، حيث تتلقى الخلايا الملتصقة بسطح ثنائي الأبعاد مجمع النقل. في حين أن النقل الأمامي لخطوط الخلايا الراسخة الأكثر شيوعا قوي والبروتوكولات منشورة جيدا ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ذات الأشكال غير أحادية الطبقة لا تنتقل بسهولة ، مما يحد من كمية NA التي يمكن تسليمها وعدد الخلايا التي تستقبلها.
تعمل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) كنموذج جذاب لفهم التطور وكأداة للطب التجديدي ، نظرا لقدرتها على الانقسام إلى أجل غير مسمى وإنتاج أي نوع من خلايا الجسم. بالنسبة ل PSCs للفأر (mPSCs) ، تحافظ ظروف الزراعة الروتينية في المختبر مع مثبطين و LIF (2i / LIF) على مورفولوجيا مستعمرة تشبه القبة ، مما يحد بشكل مباشر من عدد الخلايا المعرضة للانتقال الأمامي4،5،6. لمعالجة هذا ، يمكن إجراء نقل عكسي: تضاف الخلايا إلى طبق يحتوي على وسائط وكاشف نقل ، بدلا من إضافة كاشف نقل إلى الخلايا الملتصقة7. في حين أن هذا يزيد من عدد الخلايا المعرضة للكاشف ، فإنه يتطلب أيضا مرور الخلايا ونقلها بشكل متزامن.
بالانتقال إلى ما هو أبعد من عمليات نقل NA المفردة البسيطة ، غالبا ما يهدف الباحثون إلى توصيل العديد من تركيبات NA إلى مجموعة من الخلايا في المختبر. يتم تحقيق ذلك عادة من خلال النقل المشترك ، حيث يتم خلط NAs بنسبة معينة (1: 1 ، 9: 1 ، إلخ) ثم يتم دمجها مع كاشف النقل المختار8. ينتج عن هذا مزيج من NAs والكاشف الذي يحافظ على النسبة الأصلية من NAs إلى بعضها البعض – في حين أن الخلايا في العلاج قد تتلقى كميات مختلفة من هذا المزيج ، فإنها تتلقى جميعها نفس النسبة9. في حين أن هذا مفيد عندما تكون النسبة المطلوبة للأجزاء معروفة ، فإن تحديد هذه النسبة في وقت مبكر يمكن أن يكون كثيف العمالة ، حيث تشكل كل نسبة حالة مختلفة. أحد البدائل هو إجراء “نقل متعدد” ، حيث يتم خلط NAs الفردية مع كاشف النقل بشكل مستقل عن بعضها البعض9. من خلال الجمع بين مجمعات النقل التي تحتوي على NAs الفردية (بدلا من الجمع بين NAs قبل إنشاء المجمعات) ، يمكن للباحثين استكشاف مجموعة واسعة من مقاييس NA المتكافئة في تجربة نقل واحدة9. هذا مهم بشكل خاص في الحالات التي يتوقع فيها أن تتفاعل منتجات العديد من NAs مع بعضها البعض ، مثل أنظمة النسخ المستحثة أو الأنظمة ذات التعليقات المضمنة في1،10،11. ومع ذلك ، للقيام بذلك بشكل فعال ، هناك حاجة إلى كفاءة نقل عالية. في الواقع ، مع زيادة عدد NAs الفريدة المنقولة ، فإن احتمال تلقي خلية معينة لجميع NAs المطلوبة يتناقص أضعافا مضاعفة 9,12.
يصف التقرير التالي بروتوكول النقل العكسي ل mPSCs باستخدام كاشف نقل قائم على الدهون الكاتيونية ، حيث تتعرض الخلايا لمزيج الكاشف – NA لمدة أقصاها 5 دقائق لزيادة الجدوى وتقليل الوقت خارج ظروف الاستزراع النموذجية. توضح مقارنة هذا البروتوكول بالنقل الأمامي القياسي لهذه الخلايا كفاءة نقل أعلى وزيادة في العدد الإجمالي للخلايا المنقولة الباقية. من خلال الجمع بين هذا النقل العكسي مع ثلاثة بلازميد متعدد النقل الذي يتضمن مراسلين فلورسنت بسيطين ، يتم إثبات إمكانية موسعة لفحص نسب NA بكفاءة نقل عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن الأسباب الرئيسية لاعتماد بروتوكولات النقل على نطاق واسع إمكانية استنساخها وإمكانية الوصول إليها؛ ومع ذلك ، تتطلب هذه البروتوكولات التحسين عبر السياقات التجريبية. لم يذكر أعلاه هو الاختبار القياسي المطلوب عند محاولة نقل خط خلية جديد لأول مرة. أولا ، يعد اختيار كاشف النقل أمرا أساسيا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون الاعتراف بالعديد من المساهمات في هذا المجال التي لم يتم ذكرها في هذا العمل بسبب قيود المساحة ، وكذلك وكالات التمويل التي أتاحت هذه الفرصة. يقر المؤلفون بالتمويل المقدم من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، التي دعمت هذا العمل. حصل KM على منحة CGS-M من NSERC ومنحة Killam للدكتوراه من جامعة كولومبيا البريطانية. N.S. هو الحائز على جائزة مايكل سميث للبحوث الصحية BC Scholar.
Materials
| Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
| Apotransferrin | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Gibco | 15260-037 | |
| CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
| DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
| Flow cytometry standardization beads | Spherotech | URCP-38-2K | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G1890 | |
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin | Gibco | 12585-0014 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Neurobasal media | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
| Progesterone | MilliporeSigma | P8783 | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Putrescine | MilliporeSigma | P6780 | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Recombinant mLIF | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
| Sodium selenite | MilliporeSigma | S5261-25G | Chemical hazard – consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
References
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
- FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. PLoS One. 8 (12), 81156 (2013).
- Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states. BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).
- Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), 173146 (2019).
- Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).
- Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 11165 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A "poly-transfection" method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection. Journal of Visualized Experiments. (192), e64793 (2023).
- Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
- Teague, B. Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2023).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PLoS One. 5 (5), 0010611 (2010).
