Technique de poly-transfection inverse optimisée à base de cellules souches embryonnaires de souris pour l’exploration rapide des ratios d’acides nucléiques

L’administration d’ADN et d’ARN dans les cellules de mammifères constitue un pilier central de la recherche biomédicale¹. Une méthode courante pour introduire des acides nucléiques exogènes (NA) dans les cellules de mammifères est la transfection transitoire ^2,3. Cette technique repose sur le mélange de NA avec des réactifs de transfection disponibles dans le commerce capables de les délivrer dans les cellules réceptrices. En règle générale, l’AN est délivré par transfection directe, où les cellules adhérant à une surface bidimensionnelle reçoivent le complexe de transfection. Bien que la transfection directe pour les lignées cellulaires établies les plus courantes soit robuste et que les protocoles soient bien publiés, les types de cellules plus spécialisés avec des morphologies non monocouches ne transfectent pas facilement, ce qui limite la quantité d’AN qui peut être délivrée et le nombre de cellules qui la reçoivent.

Les cellules souches pluripotentes (CSP) constituent un modèle attrayant pour comprendre le développement et un outil pour la médecine régénérative, étant donné leur capacité à se diviser indéfiniment et à produire n’importe quel type de cellules corporelles. Pour les CSP de souris (CSPm), les conditions de culture in vitro de routine avec 2 inhibiteurs et LIF (2i/LIF) maintiennent une morphologie de colonie en forme de dôme, limitant directement le nombre de cellules exposées à une transfection vers l’avant ^4,5,6. Pour résoudre ce problème, une transfection inverse peut être effectuée : les cellules sont ajoutées à une boîte contenant un milieu et un réactif de transfection, plutôt que d’ajouter du réactif de transfection aux cellules adhérentes⁷. Bien que cela augmente le nombre de cellules exposées au réactif, cela nécessite également que les cellules soient traversées et transfectées simultanément.

Au-delà des simples transfections d’une seule NA, les chercheurs visent souvent à introduire plusieurs constructions d’AN dans une population de cellules in vitro. Ceci est généralement réalisé par une co-transfection, où les AN sont mélangés à un rapport donné (1:1, 9:1, etc.) et sont ensuite combinés avec le réactif de transfection^{choisi 8}. Cela donne un mélange d’AN et de réactif qui préserve le rapport d’origine des AN les uns par rapport aux autres – bien que les cellules du traitement puissent recevoir des quantités différentes de ce mélange, elles reçoivent toutes le même rapport⁹. Bien que cela soit avantageux lorsque le rapport souhaité de pièces est connu, déterminer ce rapport à l’avance peut demander beaucoup de travail, chaque rapport constituant une condition différente. Une alternative consiste à effectuer une « poly-transfection », où les AN individuels sont mélangés avec le réactif de transfection indépendamment les uns des autres⁹. En combinant des complexes de transfection contenant des AN individuels (plutôt que de combiner des AN avant de créer les complexes), les chercheurs peuvent explorer un large éventail de stœchiométries d’AN en une seule expérience de transfection⁹. Ceci est particulièrement utile dans les cas où les produits de plusieurs NA sont censés interagir les uns avec les autres, comme avec des systèmes de transcription inductibles ou des systèmes avec rétroaction intégrée en ^1,10,11. Cependant, pour le faire efficacement, une efficacité de transfection élevée est nécessaire. En effet, à mesure que le nombre d’AN transfectés uniques augmente, la probabilité qu’une cellule donnée reçoive tous les AN souhaités diminue de façon exponentielle ^9,12.

Le rapport suivant décrit un protocole de transfection inverse pour les CSPm utilisant un réactif de transfection à base de lipides cationiques, dans lequel les cellules sont exposées au mélange réactif-NA pendant un maximum de 5 minutes pour maximiser la viabilité et minimiser le temps en dehors des conditions de culture typiques. La comparaison de ce protocole à la transfection directe standard de ces cellules démontre une efficacité de transfection plus élevée et une augmentation du nombre total de cellules transfectées survivantes. En combinant cette transfection inverse avec une poly-transfection à trois plasmides impliquant de simples rapporteurs fluorescents, un potentiel élargi de criblage des rapports NA avec une efficacité de transfection élevée est démontré.