Nükleik Asit Oranlarının Hızlı Araştırılması için Optimize Edilmiş Bir Fare Embriyonik Kök Hücre Tabanlı Ters Poli-Transfeksiyon Tekniği

DNA ve RNA’nın memeli hücrelerine verilmesi, biyomedikal araştırmaların temel direği olarak hizmet eder¹. Ekzojen nükleik asitleri (NA) memeli hücrelerine sokmak için yaygın bir yöntem, geçici transfeksiyon ^2,3’tür. Bu teknik, NA’nın alıcı hücrelere iletebilen ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karıştırılmasına dayanır. Tipik olarak, NA, iki boyutlu bir yüzeye yapışan hücrelerin transfeksiyon kompleksini aldığı ileri transfeksiyon yoluyla iletilir. En yaygın olarak kurulan hücre hatları için ileri transfeksiyon sağlam ve protokoller iyi yayınlanmış olsa da, tek tabakalı olmayan morfolojilere sahip daha niş hücre tipleri kolayca transfekte olmaz, bu da verilebilecek NA miktarını ve onu alan hücre sayısını sınırlar.

Pluripotent kök hücreler (PSC’ler), süresiz olarak bölünme ve herhangi bir vücut hücresi tipi üretme yetenekleri göz önüne alındığında, gelişimi anlamak için çekici bir model ve rejeneratif tıp için bir araç olarak hizmet eder. Fare PSC’leri (mPSC’ler) için, 2 inhibitör ve LIF (2i/LIF) içeren rutin in vitro kültür koşulları, kubbe benzeri bir koloni morfolojisini koruyarak ileri transfeksiyona maruz kalan hücre sayısını doğrudan sınırlar ^4,5,6. Bunu ele almak için, bir ters transfeksiyon gerçekleştirilebilir: hücreler, yapışkan hücrelere transfeksiyon reaktifi eklemek yerine, ortam ve transfeksiyon reaktifi içeren bir kaba^{eklenir 7}. Bu, reaktife maruz kalan hücre sayısını artırırken, aynı zamanda hücrelerin aynı anda geçişini ve transfekte edilmesini gerektirir.

Basit tek NA transfeksiyonlarının ötesine geçerek, araştırmacılar genellikle birkaç NA yapısını in vitro bir hücre popülasyonuna iletmeyi amaçlarlar. Bu tipik olarak, NA’ların belirli bir oranda (1:1, 9:1, vb.) karıştırıldığı ve daha sonra seçilen transfeksiyon reaktifi⁸ ile birleştirildiği bir ko-transfeksiyon yoluyla elde edilir. Bu, NA’ların orijinal oranını koruyan bir NA ve reaktif karışımı verir – tedavideki hücreler bu karışımın farklı miktarlarını alabilirken, hepsi aynı oranı^{alır 9}. İstenilen parça oranı bilindiğinde bu avantajlı olsa da, bu oranın önceden belirlenmesi emek yoğun olabilir ve her oran farklı bir koşul oluşturur. Bir alternatif, tek tek NA’ların transfeksiyon reaktifi ile birbirinden bağımsız olarak karıştırıldığı bir “poli-transfeksiyon” gerçekleştirmektir⁹. Araştırmacılar, tek tek NA’ları içeren transfeksiyon komplekslerini birleştirerek (kompleksleri oluşturmadan önce NA’ları birleştirmek yerine), tek bir transfeksiyon deneyinde çok çeşitli NA stokiyometrilerini keşfedebilirler⁹. Bu, indüklenebilir transkripsiyon sistemleri veya ^1,10,11’de yerleşik geri beslemeli sistemler gibi birkaç NA’nın ürünlerinin birbiriyle etkileşime girmesinin beklendiği durumlarda özellikle değerlidir. Bununla birlikte, bunu etkili bir şekilde yapmak için yüksek bir transfeksiyon verimliliğine ihtiyaç vardır. Gerçekten de, benzersiz transfekte edilmiş NA’ların sayısı arttıkça, belirli bir hücrenin istenen tüm NA’ları alma olasılığı katlanarak^{azalır 9,12}.

Aşağıdaki rapor, canlılığı en üst düzeye çıkarmak ve tipik kültür koşullarının dışındaki süreyi en aza indirmek için hücrelerin maksimum 5 dakika boyunca reaktif-NA karışımına maruz bırakıldığı katyonik lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi kullanan mPSC’ler için bir ters transfeksiyon protokolünü açıklamaktadır. Bu protokolün bu hücrelerin standart ileri transfeksiyonu ile karşılaştırılması, daha yüksek bir transfeksiyon verimliliği ve hayatta kalan transfekte edilmiş hücrelerin toplam sayısında bir artış olduğunu göstermektedir. Bu ters transfeksiyonu, basit floresan raportörleri içeren üç plazmit poli-transfeksiyon ile birleştirerek, NA oranlarını yüksek transfeksiyon verimliliği ile taramak için genişletilmiş bir potansiyel gösterilmiştir.