RGBradford:スマートフォンカメラによるタンパク質定量(英語)

下流の用途(ELISA、酵素動態、ウェスタンブロッティング、タンパク質精製、質量分析など)にかかわらず、ライフサイエンスラボでの正確な分析にはタンパク質の定量が不可欠です。二次読み出し(タンパク質の質量あたりの分析種の相対レベルを計算する)としての使用に加えて、サンプル中のタンパク質レベルは、それ自体が目的の出力になることもあります。例えば、食物資源¹や尿²のタンパク質レベルに関心を持つことができます。サンプル³のタンパク質濃度の測定には、UV吸光度の直接測定⁴、タンパク質-銅キレート化^5,6、タンパク質-色素結合比色^{アッセイ7}、タンパク質-色素結合蛍光アッセイ⁸など、多くの方法があります。タンパク質定量の関連性は、最も引用された文献^9,10のトップ3にタンパク質^測定法5,7を説明する2つの論文が存在することによって証明されています。多くの著者が、一次文献以外の文献を引用したり、何も引用しなかったりして、実際の引用を無視しているという事実にもかかわらず、Lowryタンパク質アッセイとブラッドフォードタンパク質アッセイを記述した元の論文は、それぞれ200,000>引用されています¹⁰。

ブラッドフォードアッセイの人気は、その手頃な価格、シンプルさ、スピード、感度に起因しています。このアッセイは、酸性条件下でのタンパク質と色素Coomassie Brilliant Blue Gとの相互作用に基づいています。アッセイの条件下(すなわち、低pH)では、色素は3つの形態で存在します:470 nmでλmaxを有する赤色のカチオン型。650 nmにλmaxを有する緑色の中性体。λmaxが590 nm^11,12の青色アニオン型です(図1)。カチオン型は、タンパク質の非存在下で優勢である。タンパク質が色素と相互作用すると、青色の陰イオン性形態が安定化し、溶液の色が茶色がかった色から青色に顕著な変化が生じます。通常、青色の色素の濃度の変化は分光光度法で定量化され、その590〜595nmでの吸光度はアッセイ中のタンパク質の量に比例します。

図1:ブラッドフォードアッセイの条件下でのクマシーブリリアントブルーG吸収スペクトル。 3 つの主要なピークには、赤色(470 nm)、緑色(650 nm)、青色(590 nm)の色素の λmax を示す矢印が付いています。スペクトルは、タンパク質の非存在下(黄色の線)および3 μg(灰色の線)および10 μg(青の線)のウシ血清アルブミンの存在下で記録されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ブラッドフォードアッセイの広範な使用は、いくつかの制限(例えば、異なるタンパク質に対するさまざまな応答¹¹、脂質¹³と界面活性剤⁷による干渉)の特定と、その性能を改善するための修飾の開発(例えば、界面活性剤^{の添加14,15}、アルカリ化^14,16、吸光度の比率の使用¹⁷)の開発につながった).アッセイ自体の変更に加えて、分析シグナルを捕捉するためのスマートフォンやカメラなどの代替デバイスの使用も説明されています18,19,20。実際、スマートフォンを携帯型化学分析装置として活用する方法の開発は、活発な研究分野です。スマートフォンを使用する動機は、これらのデバイスの手頃な価格、携帯性、使いやすさ、および広範な可用性に起因しています。

この論文では、スマートフォンを分析デバイスとして使用するRGBradfordアッセイ²⁰を使用したタンパク質定量のためのプロトコルを提供します。元のRGBradford公報²⁰とは対照的に、ここでは、色抽出プロセスを合理化する手順が導入されている。これは、無料で入手できるソフトウェアアプリケーションを利用して、マイクロプレート画像の各ウェルから色情報を自動的に抽出し、時間と労力を大幅に節約することを含みます。これは、グラフィックエディタソフトウェアアプリケーション²⁰を用いて、各ウェルから色データを1つずつ手動で取得する以前の方法に代わるものである。最終的には、スマートフォンで撮影したマイクロプレートの写真から抽出したカラーデータを使用して、サンプル中のタンパク質レベルを定量化できます。