RGBradford: Количественное определение белка с помощью камеры смартфона

Независимо от последующего использования (например, ИФА, кинетика ферментов, вестерн-блоттинг, очистка белков и масс-спектрометрия), количественное определение белка имеет решающее значение для точного анализа в лабораториях медико-биологических наук. В дополнение к их использованию в качестве вторичных индикаторов (т.е. для вычисления относительных уровней аналитов на массу белка), уровни белка в образце также могут быть желаемым результатом. Например, можно интересоваться уровнем белка в пищевых ресурсах¹ или в моче². Существует множество методов измерения концентрации белка в образцах³, в том числе прямые показания поглощения УФ-излучения⁴, хелатирование белка и меди ^5,6, колориметрические анализы^{связывания} белка с красителем 7 и флуоресцентные анализы⁸, связывающие белки с красителями. Об актуальности количественного определения белка свидетельствует наличие в топ-3 наиболее цитируемой литературы^двух работ, описывающих методы измерения белка ^{5,7 9,10}. Несмотря на то, что многие авторы пренебрегают фактическим цитированием, ссылаясь на непервичные ссылки или вообще ничего не цитируя, оригинальные статьи, описывающие белковый анализ Лоури и белковый анализ Брэдфорда, насчитывают >200 000 цитирований^каждая.

Популярность теста Брэдфорда обусловлена его доступностью, простотой, скоростью и чувствительностью. Анализ основан на взаимодействии между белками и красителем Coomassie Brilliant Blue G в кислых условиях. В условиях анализа (т.е. при низком рН) краситель существует в трех формах: красная катионная форма с λmax при 470 нм; зеленая нейтральная форма с λmax на длине волны 650 нм; и синяя анионная форма с λmax при 590 нм ^11,12 (рис. 1). Катионная форма преобладает при отсутствии белков. По мере того, как белки взаимодействуют с красителем, они стабилизируют синюю анионную форму, вызывая заметное изменение цвета раствора, от коричневатого до синего. Обычно изменение концентрации синей формы красителя количественно оценивают спектрофотометрически, поглощение которой при 590-595 нм пропорционально количеству белка в анализе.

Рисунок 1: Спектры поглощения G бриллиантового синего цвета Кумасси в условиях Брэдфордского анализа. Три основных пика отмечены стрелками, указывающими λmax красной (470 нм), зеленой (650 нм) и синей (590 нм) форм красителя. Спектры регистрировали в отсутствие белка (желтая линия) и в присутствии 3 мкг (серая линия) и 10 мкг (синяя линия) бычьего сывороточного альбумина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Широкое использование анализа Брэдфорда привело к выявлению ряда ограничений (например, вариабельная реакция на различные белки¹¹ и интерференция липидов¹³ и детергентов⁷) и разработке модификаций для улучшения его характеристик (например, добавление детергентов^14,15, подщелачивание^14,16 и использование коэффициента абсорбции¹⁷). В дополнение к модификациям в самом анализе, также было описано использование альтернативных устройств, таких как смартфоны или камеры, для захвата аналитических сигналов ^18,19,20. Действительно, разработка методов, использующих смартфоны в качестве портативных химических анализаторов, была активной областью исследований. Мотивация использования смартфонов проистекает из доступности, портативности, простоты использования и широкой доступности этих устройств.

В данной работе представлен протокол количественного определения белка с использованием теста RGBradford²⁰, в котором в качестве аналитического устройства используется смартфон. В отличие от оригинальной публикации RGBradford²⁰, здесь была введена процедура, которая упрощает процесс извлечения цвета. Он включает в себя использование свободно доступного программного приложения для автоматического извлечения информации о цвете из каждой лунки изображения на микропластине, что значительно экономит время и усилия. Это альтернатива предыдущему методу ручного получения цветовых данных из каждой скважины по отдельности с помощью графического редактора²⁰. В конечном счете, уровни белка в образцах могут быть количественно определены с помощью цветовых данных, извлеченных из изображения микропланшета, сделанного с помощью смартфона.