RGBradford: Akıllı Telefon Kamerası ile Protein Kantitasyonu

Aşağı akış kullanımından bağımsız olarak (örneğin, ELISA, enzim kinetiği, western blotlama, protein saflaştırma ve kütle spektrometresi), yaşam bilimleri laboratuvarlarında doğru analiz için protein miktar tayini çok önemlidir. İkincil okumalar olarak kullanımlarına ek olarak (yani, protein kütlesi başına analitlerin nispi seviyelerini hesaplamak için), bir numunedeki protein seviyeleri de istenen çıktının kendisi olabilir. Örneğin, gıda kaynakları¹ veya idrar^2’deki protein seviyeleri ile ilgilenilebilir. Doğrudan UV absorbans okumaları 4, protein-bakır şelasyonu ^5,6, protein boyası bağlayıcı kolorimetrik deneyler 7 ve protein boyası bağlayıcı floresan deneyleri 8 dahil olmak üzere numunelerde³ protein konsantrasyonunu ölçmek için birçok yöntem mevcuttur. Protein kantitasyonunun önemi, en çok alıntı yapılan literatürün ^5,7’ünde protein ölçüm yöntemlerini^5,7 açıklayan iki makalenin^{varlığıyla} kanıtlanmıştır ^9,10. Birçok yazarın birincil olmayan referanslara atıfta bulunarak veya hiçbir şeyden alıntı yapmayarak gerçek alıntılarını ihmal etmesine rağmen, Lowry protein tahlilini ve Bradford protein tahlilini açıklayan orijinal makalelerin her^{biri 10} >200.000 alıntıdır.

Bradford testinin popülaritesi, satın alınabilirliğinden, basitliğinden, hızından ve hassasiyetinden kaynaklanmaktadır. Test, asidik koşullar altında proteinler ve Coomassie Brilliant Blue G boyası arasındaki etkileşime dayanmaktadır. Tahlil koşulları altında (yani, düşük pH), boya üç şekilde bulunur: λ ile kırmızı katyonik formmaks 470 nm’de; λmax 650 nm’de yeşil nötr bir form; ve λ ile mavi anyonik formmaks 590 nm ^11,12’de (Şekil 1). Katyonik form, proteinlerin yokluğunda baskındır. Proteinler boya ile etkileşime girdiğinde, mavi anyonik formu stabilize ederek çözeltinin renginde kahverengimsiden maviye gözle görülür bir değişikliğe neden olurlar. Genellikle, boyanın mavi formunun konsantrasyonundaki değişiklik, 590-595 nm’deki absorbansı tahlildeki protein miktarı ile orantılı olan spektrofotometrik olarak ölçülür.

Şekil 1: Bradford testi koşulları altında Coomassie parlak mavi G absorpsiyon spektrumları. Üç ana tepe noktası, boyanın kırmızı (470 nm), yeşil (650 nm) ve mavi (590 nm) formlarının λmax’ını gösteren oklarla işaretlenmiştir. Spektrumlar, protein yokluğunda (sarı çizgi) ve 3 μg (gri çizgi) ve 10 μg (mavi çizgi) sığır serum albümini varlığında kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bradford testinin yaygın kullanımı, çeşitli sınırlamaların tanımlanmasına (örneğin, farklı proteinlere¹¹ değişken tepkiler ve lipitler¹³ ve deterjanlar⁷ tarafından girişim) ve performansını iyileştirmek için modifikasyonların geliştirilmesine yol açmıştır (örneğin, deterjanların^{eklenmesi 14,15}, alkalinizasyon^14,16 ve absorbans oranının kullanılması¹⁷). Testin kendisindeki değişikliklere ek olarak, analitik sinyalleri yakalamak için akıllı telefonlar veya kameralar gibi alternatif cihazların kullanımı da tanımlanmıştır 18,19,20. Gerçekten de, akıllı telefonları taşınabilir kimyasal analizörler olarak kullanan yöntemlerin geliştirilmesi aktif bir araştırma alanı olmuştur. Akıllı telefonların kullanım motivasyonu, bu cihazların satın alınabilirliğinden, taşınabilirliğinden, kullanım kolaylığından ve yaygın olarak bulunmasından kaynaklanmaktadır.

Bu makale, analitik bir cihaz olarak bir akıllı telefon kullanan RGBradford testi^20’yi kullanarak protein ölçümü için bir protokol sağlar. Orijinal RGBradford yayını^20’nin aksine, burada renk çıkarma işlemini kolaylaştıran bir prosedür tanıtıldı. Bir mikroplaka resminin her bir kuyucuğundan renk bilgilerini otomatik olarak çıkarmak için ücretsiz olarak kullanılabilen bir yazılım uygulamasının kullanılmasını içerir, bu da önemli ölçüde zaman ve emek tasarrufu sağlar. Bu, bir grafik düzenleme yazılımı uygulaması²⁰ kullanarak her bir kuyudan renk verilerini tek tek manuel olarak elde etmenin önceki yöntemine bir alternatiftir. Sonuç olarak, numunelerdeki protein seviyeleri, bir akıllı telefonla çekilen bir mikroplaka resminden çıkarılan renk verileri kullanılarak ölçülebilir.