RGBradford: כימות חלבונים עם מצלמת סמארטפון
Summary
מאמר זה מספק פרוטוקול לכימות חלבונים באמצעות בדיקת ברדפורד וטלפון חכם כמכשיר אנליטי. ניתן לכמת את רמות החלבון בדגימות באמצעות נתוני צבע שחולצו מתמונה של צלחת מיקרו שצולמה באמצעות טלפון חכם.
Abstract
כימות חלבונים הוא הליך חיוני במחקר מדעי החיים. בין מספר שיטות אחרות, מבחן ברדפורד הוא אחד הנפוצים ביותר. בגלל נפוצותו, המגבלות והיתרונות של מבחן ברדפורד דווחו באופן ממצה, כולל מספר שינויים של השיטה המקורית כדי לשפר את הביצועים שלה. אחד השינויים בשיטה המקורית הוא השימוש במצלמת סמארטפון כמכשיר אנליטי. תוך ניצול שלוש הצורות של צבע Coomassie Brilliant Blue הקיימות בתנאים של מבחן ברדפורד, מאמר זה מתאר כיצד לכמת במדויק חלבון בדגימות באמצעות נתוני צבע שחולצו מתמונה אחת של מיקרו-לוחית. לאחר ביצוע הבדיקה במיקרו-לוחית, התמונה מצולמת באמצעות מצלמת סמארטפון, ונתוני צבע RGB מופקים מהתמונה באמצעות יישום תוכנה חינמי וקוד פתוח לניתוח תמונות. לאחר מכן, היחס בין עוצמה כחולה לירוקה (בסולם RGB) של דגימות עם ריכוזים לא ידועים של חלבון משמש לחישוב תכולת החלבון בהתבסס על עקומה סטנדרטית. לא נצפה הבדל משמעותי בין ערכים המחושבים באמצעות נתוני צבע RGB לבין ערכים המחושבים באמצעות נתוני ספיגה רגילים.
Introduction
ללא קשר לשימוש במורד הזרם (למשל, ELISA, קינטיקה של אנזימים, כתמים מערביים, טיהור חלבונים וספקטרומטריית מסות), כימות חלבונים חיוני לניתוח מדויק במעבדות מדעי החיים. בנוסף לשימוש בהם כקריאות משניות (כלומר, כדי לחשב רמות יחסיות של אנליטים לכל מסת חלבון), רמות חלבון במדגם יכולות להיות גם הפלט הרצוי עצמו. לדוגמה, אפשר להתעניין ברמות החלבון במשאבי מזון1 או בשתן2. ישנן שיטות רבות זמינות למדידת ריכוז החלבון בדגימות3, כולל קריאות ספיגת UV ישירות4, כלציה חלבון-נחושת 5,6, בדיקות קולורימטריות קושרות צבע חלבון7, ומבחני פלורסנט קושרי צבע חלבון8. הרלוונטיות של כימות החלבונים באה לידי ביטוי בנוכחותם של שני מאמרים המתארים שיטות מדידת חלבונים 5,7 בטופ-3 של הספרות המצוטטת ביותר 9,10. למרות העובדה שמחברים רבים מזניחים את הציטוט האמיתי שלהם על ידי ציטוט הפניות לא ראשוניות או לא מצטטים שום דבר בכלל, המאמרים המקוריים המתארים את בדיקת החלבון של לורי ואת בדיקת חלבון ברדפורד מסתכמים >200,000 ציטוטים כלאחד 10.
הפופולריות של מבחן ברדפורד נובעת מהמחיר, הפשטות, המהירות והרגישות שלו. הבדיקה מבוססת על האינטראקציה בין חלבונים לבין הצבע Coomassie Brilliant Blue G בתנאים חומציים. בתנאי הבדיקה (כלומר, pH נמוך), הצבע קיים בשלוש צורות: צורה קטיונית אדומה עם λmax ב 470 ננומטר; צורה נייטרלית ירוקה עם λmax ב 650 ננומטר; וצורה אניונית כחולה עם λmax ב-590 ננומטר11,12 (איור 1). הצורה הקטיונית שולטת בהיעדר חלבונים. כאשר חלבונים מתקשרים עם הצבע, הם מייצבים את הצורה האניונית הכחולה, וגורמים לשינוי ניכר בצבע התמיסה, מחום לכחול. בדרך כלל, השינוי בריכוז הצורה הכחולה של הצבע מכומת באופן ספקטרופוטומטרי, שספיגתו ב 590-595 ננומטר פרופורציונלית לכמות החלבון בבדיקה.
איור 1: ספקטרום בליעת G כחול מבריק של קומאסי בתנאים של ניסוי ברדפורד. שלוש הפסגות העיקריות מסומנות בחצים המציינים את λmax של הצורות האדום (470 ננומטר), הירוק (650 ננומטר) והכחול (590 ננומטר) של הצבע. ספקטרום תועד בהיעדר חלבון (קו צהוב) ובנוכחות 3 מיקרוגרם (קו אפור) ו -10 מיקרוגרם (קו כחול) של אלבומין בסרום בקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
השימוש הנרחב בבדיקת ברדפורד הוביל לזיהוי מספר מגבלות (למשל, תגובות משתנות לחלבונים שונים11, והפרעות על ידי ליפידים13 ודטרגנטים7) ופיתוח שינויים לשיפור ביצועיו (למשל, הוספת דטרגנטים14,15, אלקליניזציה14,16 ושימוש ביחס הספיגות17). בנוסף לשינויים בבדיקה עצמה, השימוש במכשירים חלופיים, כגון טלפונים חכמים או מצלמות, כדי ללכוד אותות אנליטיים תוארו גם 18,19,20. ואכן, פיתוח שיטות המשתמשות בסמארטפונים כאנלייזרים כימיים ניידים היה תחום מחקר פעיל. המוטיבציה לשימוש בסמארטפונים נובעת מהמחיר הנוח, הניידות, קלות השימוש והזמינות הרחבה של מכשירים אלה.
מאמר זה מספק פרוטוקול לכימות חלבונים באמצעות בדיקת RGBradford20, המשתמשת בטלפון חכם כמכשיר אנליטי. בניגוד לפרסום המקורי של RGBradford20, כאן הוצג הליך המייעל את תהליך מיצוי הצבע. זה כרוך בשימוש ביישום תוכנה זמין באופן חופשי כדי לחלץ מידע צבע מכל באר של תמונת microplate באופן אוטומטי, חוסך זמן ומאמץ משמעותיים. זוהי חלופה לשיטה הקודמת של רכישה ידנית של נתוני צבע מכל באר אחד אחד באמצעות יישום תוכנת עורך גרפי20. בסופו של דבר, ניתן לכמת את רמות החלבון בדגימות באמצעות נתוני צבע שחולצו מתמונה של מיקרו-צלחת שצולמה באמצעות טלפון חכם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את RGBradford, שיטה המשתמשת במצלמת סמארטפון כדי להקליט נתונים מבדיקת חלבון ברדפורד, לחלץ נתוני צבע ולכמת במדויק את רמות החלבונים בדגימות ביולוגיות כפי שתואר במקורלאחרונה 20. הבדל אחד משיטת RGBradford המקורית הוא שכאן נעשה שימוש בהליך לקבלת נתוני צבע באופן אוטומטי עם תוסף Ima…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq, ברזיל) [מספרי מענקים 428048/2018-8 ו-402556/2022-4] ואוניברסיטת ברזיליה (ברזיל). המחבר מודה לד”ר דוארטה נונו קרבליו וד”ר אוולין סנטוס (i3s, פורטו, פורטוגל) על מתן גישה לסמארטפונים שלהם המשמשים במחקר זה.
Materials
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L. Determination of total protein. Methods in Enzymology. 91, 95-119 (1983).
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R. The top 100 papers. Nature. 514 (7524), 550-553 (2014).
- . Scopus Available from: https://www.scopus.com/ (2022)
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -. B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. Journal of Visualized Experiments. (38), 1918 (2010).
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
