RGBradford : Quantification des protéines avec l’appareil photo d’un smartphone

Quelle que soit l’utilisation en aval (par exemple, ELISA, cinétique enzymatique, transfert Western, purification des protéines et spectrométrie de masse), la quantification des protéines est cruciale pour une analyse précise dans les laboratoires des sciences de la vie. En plus de leur utilisation comme lectures secondaires (c’est-à-dire pour calculer les niveaux relatifs d’analytes par masse de protéines), les niveaux de protéines dans un échantillon peuvent également être le résultat souhaité lui-même. Par exemple, on peut s’intéresser aux teneurs en protéines des ressources alimentaires¹ ou dans l’urine². Il existe de nombreuses méthodes disponibles pour mesurer la concentration de protéines dans les échantillons³, y compris les lectures directes d’absorbance UV⁴, la chélation protéine-cuivre ^5,6, les tests colorimétriques de liaison protéine-colorant⁷ et les tests fluorescents de liaison protéine-colorant⁸. La pertinence de la quantification des protéines est mise en évidence par la présence de deux articles décrivant les méthodes de mesure des protéines ^5,7 dans le top-3 de la littérature la plus citée ^9,10. Malgré le fait que de nombreux auteurs négligent leur citation réelle en citant des références non primaires ou en ne citant rien du tout, les articles originaux décrivant le test protéique de Lowry et le test protéique de Bradford s’élèvent > 200 000 citations chacun^{des 10}.

La popularité du test Bradford découle de son prix abordable, de sa simplicité, de sa rapidité et de sa sensibilité. Le test est basé sur l’interaction entre les protéines et le colorant Coomassie Brilliant Blue G dans des conditions acides. Dans les conditions de l’essai (c’est-à-dire un pH bas), le colorant existe sous trois formes : une forme cationique rouge avec λmax à 470 nm ; une forme neutre verte avec λmax à 650 nm ; et une forme anionique bleue avec λmax à 590 nm^11,12 (Figure 1). La forme cationique prédomine en l’absence de protéines. Au fur et à mesure que les protéines interagissent avec le colorant, elles stabilisent la forme anionique bleue, provoquant un changement notable de la couleur de la solution, de brunâtre à bleu. Habituellement, le changement de concentration de la forme bleue du colorant est quantifié par spectrophotométrie, dont l’absorbance à 590-595 nm est proportionnelle à la quantité de protéines dans le test.

Figure 1 : Spectres d’absorption G bleu brillant de Coomassie dans les conditions de l’essai de Bradford. Les trois pics principaux sont marqués par des flèches indiquant le λmax des formes rouge (470 nm), verte (650 nm) et bleue (590 nm) du colorant. Les spectres ont été enregistrés en l’absence de protéines (raie jaune) et en présence de 3 μg (raie grise) et 10 μg (raie bleue) d’albumine sérique bovine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’utilisation généralisée du test de Bradford a conduit à l’identification de plusieurs limites (par exemple, des réponses variables à différentes protéines¹¹ et à l’interférence des lipides¹³ et des détergents⁷) et à la mise au point de modifications pour améliorer ses performances (par exemple, l’ajout de détergents^14,15, l’alcalinisation^14,16 et l’utilisation du rapport d’absorbances¹⁷). En plus des modifications apportées au test lui-même, l’utilisation d’appareils alternatifs, tels que des smartphones ou des appareils photo, pour capturer des signaux analytiques a également été décrite 18,19,20. En effet, le développement de méthodes qui utilisent les smartphones comme analyseurs chimiques portables a été un domaine de recherche actif. La motivation pour l’utilisation des smartphones découle de l’abordabilité, de la portabilité, de la facilité d’utilisation et de la disponibilité généralisée de ces appareils.

Cet article fournit un protocole pour la quantification des protéines à l’aide du test RGBradford²⁰, qui utilise un smartphone comme dispositif d’analyse. Contrairement à la publication originale RGBradford²⁰, ici, une procédure qui rationalise le processus d’extraction des couleurs a été introduite. Il s’agit de l’utilisation d’une application logicielle disponible gratuitement pour extraire automatiquement les informations de couleur de chaque puits d’une image de microplaque, ce qui permet d’économiser beaucoup de temps et d’efforts. Il s’agit d’une alternative à la méthode précédente consistant à acquérir manuellement les données de couleur de chaque puits un par un à l’aide d’un logiciel d’édition graphique²⁰. En fin de compte, les niveaux de protéines dans les échantillons peuvent être quantifiés à l’aide de données de couleur extraites d’une photo d’une microplaque prise avec un smartphone.