RGBradford: كمية البروتين مع كاميرا الهاتف الذكي
Summary
توفر هذه الورقة بروتوكولا لقياس كمية البروتين باستخدام مقايسة برادفورد والهاتف الذكي كجهاز تحليلي. يمكن قياس مستويات البروتين في العينات باستخدام بيانات الألوان المستخرجة من صورة صفيحة دقيقة تم التقاطها باستخدام هاتف ذكي.
Abstract
كمية البروتين هو إجراء أساسي في أبحاث علوم الحياة. من بين العديد من الطرق الأخرى ، يعد اختبار برادفورد أحد أكثر الطرق استخداما. بسبب انتشاره على نطاق واسع ، تم الإبلاغ عن قيود ومزايا اختبار برادفورد بشكل شامل ، بما في ذلك العديد من التعديلات على الطريقة الأصلية لتحسين أدائها. أحد تعديلات الطريقة الأصلية هو استخدام كاميرا الهاتف الذكي كأداة تحليلية. بالاستفادة من الأشكال الثلاثة لصبغة Coomassie Brilliant Blue الموجودة في ظروف فحص برادفورد ، تصف هذه الورقة كيفية تحديد كمية البروتين بدقة في العينات باستخدام بيانات الألوان المستخرجة من صورة واحدة للصفيحة الدقيقة. بعد إجراء الفحص في لوحة دقيقة ، يتم التقاط صورة باستخدام كاميرا الهاتف الذكي ، ويتم استخراج بيانات ألوان RGB من الصورة باستخدام تطبيق برمجي مجاني ومفتوح المصدر لتحليل الصور. بعد ذلك ، يتم استخدام نسبة الكثافة الزرقاء إلى الخضراء (في مقياس RGB) للعينات ذات التركيزات غير المعروفة من البروتين لحساب محتوى البروتين بناء على منحنى قياسي. لم يلاحظ فرق كبير بين القيم المحسوبة باستخدام بيانات ألوان RGB وتلك المحسوبة باستخدام بيانات الامتصاص التقليدية.
Introduction
بغض النظر عن الاستخدام النهائي (على سبيل المثال ، ELISA ، حركية الإنزيم ، النشاف الغربي ، تنقية البروتين ، وقياس الطيف الكتلي) ، فإن القياس الكمي للبروتين أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق في مختبرات علوم الحياة. بالإضافة إلى استخدامها كقراءات ثانوية (أي لحساب المستويات النسبية للتحليلات لكل كتلة من البروتين) ، يمكن أن تكون مستويات البروتين في العينة هي المخرجات المطلوبة نفسها. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن يهتم بمستويات البروتين في الموارد الغذائية1 أو في البول2. هناك العديد من الطرق المتاحة لقياس تركيز البروتين في العينات3 ، بما في ذلك قراءات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المباشرة4 ، واستخلاب البروتين والنحاس 5,6 ، والمقايسات اللونية لربط صبغة البروتين7 ، ومقايسات الفلورسنت المرتبطة بصبغة البروتين8. تتجلى أهمية كمية البروتين من خلال وجود ورقتين تصفان طرق قياس البروتين 5,7 في أعلى 3 من الأدبيات الأكثر استشهادا 9,10. على الرغم من حقيقة أن العديد من المؤلفين يهملون استشهادهم الفعلي من خلال الاستشهاد بمراجع غير أساسية أو عدم الاستشهاد بأي شيء على الإطلاق ، فإن الأوراق الأصلية التي تصف مقايسة بروتين لوري ومقايسة بروتين برادفورد تبلغ 200000 >اقتباس لكلمنها 10.
تنبع شعبية اختبار برادفورد من قدرته على تحمل التكاليف وبساطته وسرعته وحساسيته. يعتمد الفحص على التفاعل بين البروتينات وصبغة Coomassie Brilliant Blue G في ظل الظروف الحمضية. في ظل ظروف الفحص (أي انخفاض درجة الحموضة) ، توجد الصبغة في ثلاثة أشكال: شكل كاتيوني أحمر مع λmax عند 470 نانومتر. شكل محايد أخضر مع λmax عند 650 نانومتر ؛ وشكل أنيوني أزرق مع λmax عند 590 نانومتر11,12 (الشكل 1). يسود الشكل الكاتيوني في غياب البروتينات. عندما تتفاعل البروتينات مع الصبغة ، فإنها تعمل على استقرار الشكل الأنيوني الأزرق ، مما يتسبب في تغيير ملحوظ في لون المحلول ، من البني إلى الأزرق. عادة ، يتم قياس التغير في تركيز الشكل الأزرق للصبغة طيفيا ، حيث يتناسب امتصاصه عند 590-595 نانومتر مع كمية البروتين في الفحص.
الشكل 1: أطياف امتصاص G الزرقاء الرائعة في كوماسي تحت ظروف فحص برادفورد. تم تمييز القمم الرئيسية الثلاث بأسهم تشير إلى λmax لأشكال الصبغة الحمراء (470 نانومتر) والأخضر (650 نانومتر) والأزرق (590 نانومتر). تم تسجيل الأطياف في غياب البروتين (الخط الأصفر) وفي وجود 3 ميكروغرام (الخط الرمادي) و 10 ميكروغرام (الخط الأزرق) من ألبومين مصل الأبقار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أدى الاستخدام الواسع النطاق لمقايسة برادفورد إلى تحديد العديد من القيود (على سبيل المثال ، الاستجابات المتغيرة للبروتينات المختلفة11 ، والتداخل بواسطة الدهون13 والمنظفات7) وتطوير تعديلات لتحسين أدائها (على سبيل المثال ، إضافة المنظفات14،15 ، القلوية14،16 واستخدام نسبة الامتصاص17). بالإضافة إلى التعديلات في الفحص نفسه ، تم أيضا وصف استخدام الأجهزة البديلة ، مثل الهواتف الذكية أو الكاميرات ، لالتقاط الإشارات التحليلية18،19،20. في الواقع ، كان تطوير الأساليب التي تستخدم الهواتف الذكية كأجهزة تحليل كيميائية محمولة مجالا نشطا للبحث. ينبع الدافع لاستخدام الهواتف الذكية من القدرة على تحمل التكاليف وقابلية النقل وسهولة الاستخدام والتوافر الواسع لهذه الأجهزة.
توفر هذه الورقة بروتوكولا لقياس كمية البروتين باستخدام اختبار RGBradford20 ، والذي يستخدم الهاتف الذكي كجهاز تحليلي. على عكس منشور RGBradford الأصلي20 ، هنا ، تم تقديم إجراء يبسط عملية استخراج الألوان. إنه ينطوي على استخدام تطبيق برمجي متاح مجانا لاستخراج معلومات الألوان من كل بئر من صورة الصفيحة الدقيقة تلقائيا ، مما يوفر وقتا وجهدا كبيرين. هذا بديل للطريقة السابقة للحصول يدويا على بيانات الألوان من كل بئر واحدا تلو الآخر باستخدام تطبيق برنامج محرر الرسومات20. في النهاية ، يمكن قياس مستويات البروتين في العينات باستخدام بيانات الألوان المستخرجة من صورة صفيحة دقيقة تم التقاطها بهاتف ذكي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة RGBradford ، وهي طريقة تستخدم كاميرا الهاتف الذكي لتسجيل البيانات من فحص بروتين برادفورد ، واستخراج بيانات الألوان ، وتحديد مستويات البروتين بدقة في العينات البيولوجية كما هو موضح في الأصلمؤخرا 20. أحد الاختلافات عن طريقة RGBradford الأصلية هو أنه تم استخدام إجراء للحصو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq ، البرازيل) [أرقام المنح 428048 / 2018-8 و 402556 / 2022-4] وجامعة برازيليا (البرازيل). يشكر المؤلف الدكتور دوارتي نونو كارفالهو والدكتورة إيفلين سانتوس (i3s ، بورتو ، البرتغال) على توفير الوصول إلى هواتفهم الذكية المستخدمة في هذا البحث.
Materials
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L. Determination of total protein. Methods in Enzymology. 91, 95-119 (1983).
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R. The top 100 papers. Nature. 514 (7524), 550-553 (2014).
- . Scopus Available from: https://www.scopus.com/ (2022)
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -. B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. Journal of Visualized Experiments. (38), 1918 (2010).
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
