RGBradford: quantificazione delle proteine con la fotocamera di uno smartphone

Indipendentemente dall’uso a valle (ad esempio, ELISA, cinetica enzimatica, western blotting, purificazione delle proteine e spettrometria di massa), la quantificazione delle proteine è fondamentale per un’analisi accurata nei laboratori di scienze biologiche. Oltre al loro utilizzo come letture secondarie (ad esempio, per calcolare i livelli relativi di analiti per massa di proteine), i livelli di proteine in un campione possono anche essere l’output desiderato. Ad esempio, si può essere interessati ai livelli di proteine nelle risorse alimentari¹ o nelle urine². Sono disponibili molti metodi per misurare la concentrazione di proteine nei campioni³, tra cui le letture dirette dell’assorbanza UV⁴, la chelazione proteina-rame ^5,6, i saggi colorimetrici di legame proteina-colorante⁷ e i saggi fluorescenti di legame proteina-colorante⁸. L’importanza della quantificazione delle proteine è evidenziata dalla presenza di due articoli che descrivono i metodi di misurazione delle proteine ^5,7 nella top-3 della letteratura più citata ^9,10. Nonostante il fatto che molti autori trascurino la loro citazione effettiva citando riferimenti non primari o non citando nulla, gli articoli originali che descrivono il saggio della proteina di Lowry e il saggio della proteina di Bradford ammontano > 200.000 citazioni ciascuno¹⁰.

La popolarità del test di Bradford deriva dalla sua convenienza, semplicità, velocità e sensibilità. Il test si basa sull’interazione tra le proteine e il colorante Coomassie Brilliant Blue G in condizioni acide. Nelle condizioni del saggio (cioè pH basso), il colorante esiste in tre forme: una forma cationica rossa con λmax a 470 nm; una forma neutra verde con λmax a 650 nm; e una forma anionica blu con λmax a 590 nm^11,12 (Figura 1). La forma cationica predomina in assenza di proteine. Quando le proteine interagiscono con il colorante, stabilizzano la forma anionica blu, causando un notevole cambiamento nel colore della soluzione, da brunastro a blu. Di solito, la variazione della concentrazione della forma blu del colorante viene quantificata spettrofotometricamente, la cui assorbanza a 590-595 nm è proporzionale alla quantità di proteina nel saggio.

Figura 1: Spettri di assorbimento G blu brillante di Coomassie nelle condizioni del saggio di Bradford. I tre picchi principali sono contrassegnati da frecce che indicano il λmax delle forme rossa (470 nm), verde (650 nm) e blu (590 nm) del colorante. Gli spettri sono stati registrati in assenza di proteine (linea gialla) e in presenza di 3 μg (linea grigia) e 10 μg (linea blu) di albumina sierica bovina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L’uso diffuso del saggio di Bradford ha portato all’identificazione di diverse limitazioni (ad esempio, risposte variabili a diverse proteine¹¹ e interferenza da parte di lipidi¹³ e detergenti⁷) e allo sviluppo di modifiche per migliorarne le prestazioni (ad esempio, l’aggiunta di detergenti^14,15, l’alcalinizzazione^14,16 e l’uso del rapporto di assorbanza¹⁷). Oltre alle modifiche nel saggio stesso, è stato descritto anche l’uso di dispositivi alternativi, come smartphone o fotocamere, per catturare i segnali analitici 18,19,20. In effetti, lo sviluppo di metodi che utilizzano gli smartphone come analizzatori chimici portatili è stata un’area di ricerca attiva. La motivazione per l’uso degli smartphone deriva dall’accessibilità, dalla portabilità, dalla facilità d’uso e dall’ampia disponibilità di questi dispositivi.

Questo documento fornisce un protocollo per la quantificazione delle proteine utilizzando il saggio RGBradford²⁰, che utilizza uno smartphone come dispositivo analitico. A differenza della pubblicazione originale^{RGBradford 20}, qui è stata introdotta una procedura che semplifica il processo di estrazione del colore. Comporta l’utilizzo di un’applicazione software disponibile gratuitamente per estrarre automaticamente le informazioni sul colore da ciascun pozzetto di un’immagine per micropiastre, risparmiando tempo e fatica significativi. Si tratta di un’alternativa al metodo precedente di acquisizione manuale dei dati di colore da ciascun pozzetto uno per uno utilizzando un’applicazione software di editor grafico²⁰. In definitiva, i livelli di proteine nei campioni possono essere quantificati utilizzando i dati a colori estratti da un’immagine di una micropiastra scattata con uno smartphone.