Summary

Анализ белка клетки-хозяина с использованием гранул обогащения в сочетании с ограниченным пищеварением

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Представлен протокол обогащения белков клетки-хозяина (ГКП) из лекарственных препаратов (ЛП) и детекции пептидов с помощью гранул обогащения протеома. Метод демонстрируется с использованием лекарственной субстанции (DS) моноклонального антитела (мАТ) собственного производства, которая является хорошо охарактеризованным эталонным материалом для оценки и сравнения различных методов с точки зрения эффективности.

Abstract

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые могут отрицательно влиять на терапевтические белки даже в небольших количествах. Для оценки потенциальных рисков, связанных с лекарственными препаратами, были разработаны методы выявления медицинских работников с низкой численностью. Важнейший подход к разработке чувствительного метода обнаружения ГКП включает обогащение СГП с одновременным удалением моноклональных антител (мАТ) перед анализом с использованием жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Этот протокол предлагает подробные инструкции по обогащению белков клетки-хозяина с помощью коммерчески доступных гранул обогащения протеома. Эти бусины содержат разнообразную библиотеку гексапептидных лигандов со специфическим сродством к различным белкам. Протокол также включает ограниченное пищеварение и последующее обнаружение пептидов с помощью нано-ЖХ-МС/МС. Используя эти методы, медицинские работники с низкой концентрацией могут быть обогащены более чем в 7000 раз, что приводит к впечатляющему пределу обнаружения до 0,002 ppm. Важно отметить, что этот протокол позволяет обнаруживать 850 медицинских работников с высоким уровнем достоверности с помощью мАТ NIST. Кроме того, он разработан так, чтобы быть удобным для пользователя, и включает в себя видеодемонстрацию, чтобы помочь в его реализации. Выполняя эти шаги, исследователи могут эффективно обогащать и выявлять медицинских работников, повышая чувствительность и точность оценки риска для лекарственных препаратов.

Introduction

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые высвобождаются из клеточной культуры организма-хозяина и совместно очищаются с моноклональными антителами (mAb)1,2,3,4. Следовые уровни ГКП могут негативно влиять на качество лекарственного препарата 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, и поэтому для выявления СГП в уровнях от менее ppm до ppm необходим чувствительный метод анализа HCP.

Ортогональные методы могут быть применены для выявления СГП в низкой численности. Иммуноферментный анализ (ИФА) обычно используется для количественного определения общего количества ГЧП, а также может выявлять и количественно определять отдельных СГП при наличии соответствующих антител16. Однако выработка HCP-специфических антител является трудоемкой и трудоемкой. В отличие от этого, жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) может предоставить исчерпывающую информацию об отдельных ГКП в лекарственных препаратах мАТ и широко применяется для идентификации ГКП 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20. 21,22,23,24,25,26,27.

Для выявления ГКП с ЖХ-МС/МС было разработано несколько методов, включая ограниченное пищеварение20, фильтрацию17, делецию белка А21, иммунопреципитацию (IP) и обогащение ProteoMiner (PM)18. Большинство методов направлены на уменьшение количества мАТ и обогащение ГКП перед анализом ЖХ-МС/МС, тем самым уменьшая динамический диапазон между пептидами мАТ и пептидами ГКП. Этот протокол представляет собой метод обогащения протеомных образцов, который сочетает в себе технологию ProteoMiner и ограниченное разложение (PMLD)28. Принцип обогащения ProteoMiner включает в себя использование коммерчески доступных гранул обогащения протеома, содержащих разнообразную библиотеку комбинаторных пептидных лигандов. Эти лиганды специфически связываются с белками на антителах-лекарственных продуктах, позволяя удалять избыточные молекулы, концентрируя белки клеток-хозяев с низкой численностью (HCP) на соответствующих аффинных лигандах. С другой стороны, принцип ограниченного пищеварения предполагает использование низкой концентрации трипсина. Эта концентрация достаточна для переваривания медицинских работников с низким содержанием, но недостаточна для переваривания всех лекарственных препаратов на основе антител. Такой подход позволяет извлекать и обогащать из раствора переваренные пептиды HCP.

По сравнению с методами фильтрации, методика PMLD не ограничена размером обнаруживаемых СГП17. Методы делеции белка А специфичны для выявления ГКП, ассоциированных с антителами21, в то время как иммунопреципитация ограничена заранее определенными ГКП из определенной клеточной линии (например, клеточной линии яичника китайского хомяка (СНО), где было выработано антитело к ГКП4. В отличие от этого, PMLD может быть применен для обнаружения HCP из любых лекарственных модулей и белков клетки-хозяина, совместно очищенных с лекарственными препаратами из различных клеточных линий. Кроме того, PMLD проявляет лучшую чувствительность по сравнению с упомянутыми методами 17,18,20,21,24.

Такой подход позволяет обогатить концентрацию ГКП в 7000 раз и снизить предел обнаружения до 0,002 ppm28. Экспериментальная установка показана на рисунке 1.

Protocol

Аббревиатуры, используемые в протоколе, приведены в дополнительной таблице 1. 1. Приготовление растворов и буферов ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие данные всех реагентов указаны в таблице материалов. Приготовьте 0,1 М раствора Tris-HCl,…

Representative Results

В этом протоколе представлен рабочий процесс подготовки образцов, называемый обогащением белка в сочетании с ограниченным пищеварением (PMLD), для анализа белков клетки-хозяина (HCP) в образце моноклонального антитела (mAb). На рисунке 1 показана пошаговая процедура PMLD. Иссле…

Discussion

Существует две версии коммерчески доступных гранул для обогащения белком: одна с меньшей емкостью, а другая с большей емкостью (см. Таблицу материалов). Обе версии бусин для обогащения содержат в упаковке по десять препов. Инструкция производителя предполагает, что каждый преп…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Никакой.

Materials

16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. . , (2023).
  30. Uniprot2. . , (2023).

Play Video

Cite This Article
Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

View Video