Анализ белка клетки-хозяина с использованием гранул обогащения в сочетании с ограниченным пищеварением
Summary
Представлен протокол обогащения белков клетки-хозяина (ГКП) из лекарственных препаратов (ЛП) и детекции пептидов с помощью гранул обогащения протеома. Метод демонстрируется с использованием лекарственной субстанции (DS) моноклонального антитела (мАТ) собственного производства, которая является хорошо охарактеризованным эталонным материалом для оценки и сравнения различных методов с точки зрения эффективности.
Abstract
Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые могут отрицательно влиять на терапевтические белки даже в небольших количествах. Для оценки потенциальных рисков, связанных с лекарственными препаратами, были разработаны методы выявления медицинских работников с низкой численностью. Важнейший подход к разработке чувствительного метода обнаружения ГКП включает обогащение СГП с одновременным удалением моноклональных антител (мАТ) перед анализом с использованием жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).
Этот протокол предлагает подробные инструкции по обогащению белков клетки-хозяина с помощью коммерчески доступных гранул обогащения протеома. Эти бусины содержат разнообразную библиотеку гексапептидных лигандов со специфическим сродством к различным белкам. Протокол также включает ограниченное пищеварение и последующее обнаружение пептидов с помощью нано-ЖХ-МС/МС. Используя эти методы, медицинские работники с низкой концентрацией могут быть обогащены более чем в 7000 раз, что приводит к впечатляющему пределу обнаружения до 0,002 ppm. Важно отметить, что этот протокол позволяет обнаруживать 850 медицинских работников с высоким уровнем достоверности с помощью мАТ NIST. Кроме того, он разработан так, чтобы быть удобным для пользователя, и включает в себя видеодемонстрацию, чтобы помочь в его реализации. Выполняя эти шаги, исследователи могут эффективно обогащать и выявлять медицинских работников, повышая чувствительность и точность оценки риска для лекарственных препаратов.
Introduction
Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые высвобождаются из клеточной культуры организма-хозяина и совместно очищаются с моноклональными антителами (mAb)1,2,3,4. Следовые уровни ГКП могут негативно влиять на качество лекарственного препарата 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, и поэтому для выявления СГП в уровнях от менее ppm до ppm необходим чувствительный метод анализа HCP.
Ортогональные методы могут быть применены для выявления СГП в низкой численности. Иммуноферментный анализ (ИФА) обычно используется для количественного определения общего количества ГЧП, а также может выявлять и количественно определять отдельных СГП при наличии соответствующих антител16. Однако выработка HCP-специфических антител является трудоемкой и трудоемкой. В отличие от этого, жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) может предоставить исчерпывающую информацию об отдельных ГКП в лекарственных препаратах мАТ и широко применяется для идентификации ГКП 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20. 21,22,23,24,25,26,27.
Для выявления ГКП с ЖХ-МС/МС было разработано несколько методов, включая ограниченное пищеварение20, фильтрацию17, делецию белка А21, иммунопреципитацию (IP) и обогащение ProteoMiner (PM)18. Большинство методов направлены на уменьшение количества мАТ и обогащение ГКП перед анализом ЖХ-МС/МС, тем самым уменьшая динамический диапазон между пептидами мАТ и пептидами ГКП. Этот протокол представляет собой метод обогащения протеомных образцов, который сочетает в себе технологию ProteoMiner и ограниченное разложение (PMLD)28. Принцип обогащения ProteoMiner включает в себя использование коммерчески доступных гранул обогащения протеома, содержащих разнообразную библиотеку комбинаторных пептидных лигандов. Эти лиганды специфически связываются с белками на антителах-лекарственных продуктах, позволяя удалять избыточные молекулы, концентрируя белки клеток-хозяев с низкой численностью (HCP) на соответствующих аффинных лигандах. С другой стороны, принцип ограниченного пищеварения предполагает использование низкой концентрации трипсина. Эта концентрация достаточна для переваривания медицинских работников с низким содержанием, но недостаточна для переваривания всех лекарственных препаратов на основе антител. Такой подход позволяет извлекать и обогащать из раствора переваренные пептиды HCP.
По сравнению с методами фильтрации, методика PMLD не ограничена размером обнаруживаемых СГП17. Методы делеции белка А специфичны для выявления ГКП, ассоциированных с антителами21, в то время как иммунопреципитация ограничена заранее определенными ГКП из определенной клеточной линии (например, клеточной линии яичника китайского хомяка (СНО), где было выработано антитело к ГКП4. В отличие от этого, PMLD может быть применен для обнаружения HCP из любых лекарственных модулей и белков клетки-хозяина, совместно очищенных с лекарственными препаратами из различных клеточных линий. Кроме того, PMLD проявляет лучшую чувствительность по сравнению с упомянутыми методами 17,18,20,21,24.
Такой подход позволяет обогатить концентрацию ГКП в 7000 раз и снизить предел обнаружения до 0,002 ppm28. Экспериментальная установка показана на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует две версии коммерчески доступных гранул для обогащения белком: одна с меньшей емкостью, а другая с большей емкостью (см. Таблицу материалов). Обе версии бусин для обогащения содержат в упаковке по десять препов. Инструкция производителя предполагает, что каждый преп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
References
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
