Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau
Summary
Es wird ein Protokoll zur Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCPs) aus Arzneimitteln (DP) und zum Nachweis von Peptiden mit Hilfe von Proteom-Anreicherungskügelchen vorgestellt. Die Methode wird anhand eines selbst hergestellten monoklonalen Antikörpers (mAb) Drug Substance (DS) demonstriert, der ein gut charakterisiertes Referenzmaterial für die Bewertung und den Vergleich verschiedener Methoden in Bezug auf die Leistung darstellt.
Abstract
Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die sich bereits in geringen Mengen negativ auf therapeutische Proteine auswirken können. Um die potenziellen Risiken im Zusammenhang mit Arzneimitteln zu bewerten, wurden Methoden entwickelt, um HCPs mit geringer Häufigkeit zu identifizieren. Ein entscheidender Ansatz für die Entwicklung einer sensitiven HCP-Nachweismethode besteht darin, HCPs anzureichern und gleichzeitig monoklonale Antikörper (mAbs) vor der Analyse mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zu entfernen.
Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Anreicherung von Wirtszellproteinen mit kommerziell erhältlichen Proteom-Anreicherungskügelchen. Diese Kügelchen enthalten eine vielfältige Bibliothek von Hexapeptid-Liganden mit spezifischen Affinitäten für verschiedene Proteine. Das Protokoll umfasst auch einen begrenzten Aufschluss und die anschließende Peptiddetektion mittels Nano-LC-MS/MS. Durch den Einsatz dieser Techniken können HCPs mit geringer Häufigkeit über 7000-fach angereichert werden, was zu einer beeindruckenden Nachweisgrenze von nur 0,002 ppm führt. Bezeichnenderweise ermöglicht dieses Protokoll die Erkennung von 850 HCPs mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit unter Verwendung eines NIST-mAbs. Darüber hinaus ist es benutzerfreundlich gestaltet und enthält eine Videodemonstration, die bei der Implementierung hilft. Durch die Befolgung dieser Schritte können Forscher HCPs effektiv anreichern und nachweisen und so die Sensitivität und Genauigkeit der Risikobewertung für Arzneimittel verbessern.
Introduction
Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die aus der Zellkultur des Wirtsorganismus freigesetzt und mit monoklonalen Antikörpern (mAb) gereinigt werden1,2,3,4. Spurenkonzentrationen von HCPs können sich negativ auf die Qualität des Arzneimittelsauswirken 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, und daher ist eine empfindliche HCP-Analysemethode erforderlich, um HCPs in Sub-ppm- bis ppm-Konzentrationen nachzuweisen.
Orthogonale Methoden können angewendet werden, um HCPs in geringer Häufigkeit zu detektieren. Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird im Allgemeinen zur Quantifizierung der gesamten HCPs verwendet und kann auch einzelne HCPs nachweisen und quantifizieren, wenn die entsprechenden Antikörper verfügbar sind16. Die Herstellung von HCP-spezifischen Antikörpern ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv. Im Gegensatz dazu kann die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC-MS) umfassende Informationen über einzelne HCPs in mAb-Arzneimitteln liefern und wird häufig für die HCP-Identifizierung eingesetzt 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um HCPs mit LC-MS/MS nachzuweisen, darunter begrenzter Aufschluss20, Filtration17, Protein-A-Deletion21, Immunpräzipitation (IP) und ProteoMiner-Anreicherung (PM)18. Die meisten Methoden zielen darauf ab, die Menge an mAb zu reduzieren und HCPs vor der LC-MS/MS-Analyse anzureichern, wodurch der dynamische Bereich zwischen mAb-Peptiden und HCP-Peptiden verringert wird. Dieses Protokoll stellt eine proteomische Probenanreicherungsmethode vor, die die ProteoMiner-Technologie und den begrenzten Aufschluss (PMLD) kombiniert28. Das Prinzip der ProteoMiner-Anreicherung beinhaltet die Verwendung kommerziell erhältlicher Proteom-Anreicherungskügelchen, die eine vielfältige Bibliothek kombinatorischer Peptidliganden enthalten. Diese Liganden binden spezifisch an Proteine auf Antikörper-Wirkstoff-Produkten und ermöglichen so die Entfernung überschüssiger Moleküle, während Wirtszellproteine (HCPs) mit geringer Häufigkeit auf ihre jeweiligen Affinitätsliganden konzentriert werden. Auf der anderen Seite beinhaltet das Prinzip der begrenzten Verdauung die Verwendung einer niedrigen Konzentration von Trypsin. Diese Konzentration reicht aus, um HCPs mit geringer Häufigkeit zu verdauen, aber nicht genug, um alle Antikörper-Wirkstoffprodukte zu verdauen. Dieser Ansatz ermöglicht die Rückgewinnung und Anreicherung von verdauten HCP-Peptiden aus der Lösung.
Im Vergleich zu Filtrationsverfahren ist die PMLD-Technik nicht durch die Größe der detektierten HCPs17 begrenzt. Protein-A-Deletionsmethoden sind spezifisch für den Nachweis von HCPs, die mit Antikörpern assoziiert sind21, während die Immunpräzipitation auf vordefinierte HCPs aus einer bestimmten Zelllinie (z. B. der Zelllinie des chinesischen Hamster-Eierstocks (CHO)) beschränkt ist, bei der ein Anti-HCP-Antikörper erzeugt wurde4. Im Gegensatz dazu kann PMLD zum Nachweis von HCPs aus beliebigen Wirkstoffmodulen und Wirtszellproteinen eingesetzt werden, die mit Arzneimitteln aus verschiedenen Zelllinien gereinigt wurden. Darüber hinaus weist PMLD eine bessere Sensitivität im Vergleich zu den genannten Methoden auf 17,18,20,21,24.
Dieser Ansatz kann die HCP-Konzentration um das 7000-fache anreichern und die Nachweisgrenze auf 0,002 ppm senken28. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei Versionen von kommerziell erhältlichen Proteinanreicherungskügelchen: eine mit kleinerer Kapazität und die andere mit größerer Kapazität (siehe Materialtabelle). Beide Versionen der Anreicherungsperlen enthalten zehn Preps in der Packung. Die Anweisungen des Herstellers deuten darauf hin, dass jedes Präparat aus dem Kit mit geringer Kapazität verwendet werden kann, um 10 mg Gesamtprotein anzureichern. Für eine optimale Leistung der Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCP) durch DS …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
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