エンリッチメントビーズと限定消化を組み合わせた宿主細胞タンパク質分析(英語)

宿主細胞タンパク質(HCP)は、宿主生物の細胞培養から放出され、モノクローナル抗体(mAb)と共精製される不純物です1,2,3,4。微量レベルのHCPは、医薬品の品質に悪影響を与える可能性があります⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、¹²、^13、14、¹⁵、したがって、サブppmからppmレベルのHCPを検出するには^、高感度のHCP分析法が望まれています。

直交的な方法を適用して、少量のHCPを検出できます。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、一般的にHCP全体の定量に使用され、対応する抗体が利用可能であれば、個々のHCPを検出して定量することもできます¹⁶。しかし、HCP特異的抗体の産生には時間と労力がかかります。対照的に、質量分析(LC-MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーは、モノクローナル抗体医薬品中の個々のHCPに関する包括的な情報を提供することができ、HCPの同定に広く適用されています4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20^, 21、22、23、24、²⁵、^26、27。

LC-MS/MS で HCP を検出するために、限定消化²⁰、ろ過¹⁷、プロテイン A 欠失²¹、免疫沈降 (IP)、ProteoMiner 濃縮 (PM)¹⁸ など、いくつかの方法が開発されています。ほとんどの分析法は、LC-MS/MS 分析の前にモノクローナル抗体の量を減らし、HCP を濃縮することで、モノクローナル抗体ペプチドと HCP ペプチドの間のダイナミックレンジを狭めることを目的としています。このプロトコルは、ProteoMiner技術と限られた消化(PMLD)を組み合わせたプロテオミクスサンプル濃縮法を提示し^ます28。ProteoMiner エンリッチメントの原理では、コンビナトリアルペプチドリガンドの多様なライブラリーを含む市販のプロテオームエンリッチメントビーズを使用します。これらのリガンドは、抗体医薬品上のタンパク質に特異的に結合し、過剰な分子を除去しながら、少量の宿主細胞タンパク質(HCP)をそれぞれのアフィニティーリガンドに濃縮します。一方、限られた消化の原則には、低濃度のトリプシンを使用することが含まれます。この濃度は、少量のHCPを消化するには十分ですが、すべての抗体医薬品を消化するには十分ではありません。このアプローチにより、溶液から消化されたHCPペプチドを回収し、濃縮することができます。

濾過法と比較して、PMLD技術は、検出されたHCPのサイズによって制限されない¹⁷。プロテインA欠失法は、抗体に結合したHCPの検出に特異的である^が21、免疫沈降は、抗HCP抗体が産生された特定の細胞株(チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株など)由来の事前定義されたHCPに限定される⁴。対照的に、PMLDは、さまざまな細胞株の医薬品と共精製された任意の薬物モジュールおよび宿主細胞タンパク質からのHCPを検出するために適用できます。さらに、PMLDは、前述の方法¹⁷、^18、20、²¹、²⁴と比較して^、より優れた感度を示します。

このアプローチにより、HCP 濃度を 7000 倍に濃縮し、検出限界を 0.002 ppm²⁸ に下げることができます。実験装置を 図1に示します。