Analisi delle proteine delle cellule ospiti utilizzando perle di arricchimento accoppiate a digestione limitata
Summary
Viene presentato un protocollo per l’arricchimento delle proteine della cellula ospite (HCP) da prodotti farmaceutici (DP) e la rilevazione di peptidi utilizzando perle di arricchimento del proteoma. Il metodo è dimostrato utilizzando una sostanza farmaceutica (DS) a base di anticorpi monoclonali (mAb) prodotta internamente, che è un materiale di riferimento ben caratterizzato per la valutazione e il confronto di diversi metodi in termini di prestazioni.
Abstract
Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che possono influire negativamente sulle proteine terapeutiche, anche in piccole quantità. Per valutare i potenziali rischi associati ai prodotti farmaceutici, sono stati sviluppati metodi per identificare gli operatori sanitari a bassa abbondanza. Un approccio cruciale per lo sviluppo di un metodo di rilevamento sensibile degli HCP prevede l’arricchimento degli HCP e la contemporanea rimozione degli anticorpi monoclonali (mAb) prima dell’analisi, utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).
Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per l’arricchimento delle proteine della cellula ospite utilizzando perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio. Queste perle contengono una libreria diversificata di ligandi esapeptidici con affinità specifiche per diverse proteine. Il protocollo incorpora anche una digestione limitata e il successivo rilevamento dei peptidi utilizzando nano LC-MS/MS. Impiegando queste tecniche, gli HCP con bassa abbondanza possono essere arricchiti di oltre 7000 volte, con un limite di rilevamento impressionante fino a 0,002 ppm. Significativamente, questo protocollo consente il rilevamento di 850 HCP con un alto livello di confidenza utilizzando un anticorpo monoclonale NIST. Inoltre, è progettato per essere facile da usare e include una dimostrazione video per assisterne l’implementazione. Seguendo questi passaggi, i ricercatori possono arricchire e rilevare efficacemente gli operatori sanitari, migliorando la sensibilità e l’accuratezza della valutazione del rischio per i prodotti farmaceutici.
Introduction
Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che vengono rilasciate dalla coltura cellulare dell’organismo ospite e co-purificate con l’anticorpo monoclonale (mAb)1,2,3,4. I livelli di tracce di HCP possono avere un impatto negativo sulla qualità del prodotto farmaceutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, pertanto, è necessario un metodo di analisi HCP sensibile per rilevare gli HCP a livelli da sub-ppm a ppm.
I metodi ortogonali possono essere applicati per rilevare gli HCP in bassa abbondanza. Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è generalmente utilizzato per quantificare gli HCP complessivi e può anche rilevare e quantificare i singoli HCP se sono disponibili gli anticorpi corrispondenti16. Tuttavia, la produzione di anticorpi specifici per l’HCP richiede molto tempo e lavoro. Al contrario, la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) può fornire informazioni complete sui singoli HCP nei prodotti farmaceutici mAb ed è ampiamente applicata per l’identificazione degli HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Sono stati sviluppati diversi metodi per rilevare gli HCP con LC-MS/MS, tra cui la digestione limitata20, la filtrazione 17, la delezione della proteina A21, l’immunoprecipitazione (IP) e l’arricchimento di ProteoMiner (PM)18. La maggior parte dei metodi mira a ridurre la quantità di anticorpi monoclonali e ad arricchire gli HCP prima dell’analisi LC-MS/MS, diminuendo così l’intervallo dinamico tra i peptidi degli anticorpi monoclonali e i peptidi HCP. Questo protocollo presenta un metodo di arricchimento del campione proteomico che combina la tecnologia ProteoMiner e la digestione limitata (PMLD)28. Il principio di arricchimento di ProteoMiner prevede l’utilizzo di perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio contenenti una libreria diversificata di ligandi peptidici combinatori. Questi ligandi si legano specificamente alle proteine sui prodotti anticorpali-farmacologici, consentendo la rimozione delle molecole in eccesso e concentrando le proteine delle cellule ospiti (HCP) a bassa abbondanza sui rispettivi ligandi di affinità. D’altra parte, il principio della digestione limitata prevede l’utilizzo di una bassa concentrazione di tripsina. Questa concentrazione è sufficiente per digerire gli HCP a bassa abbondanza, ma non sufficiente per digerire tutti i farmaci anticorpali. Questo approccio consente il recupero e l’arricchimento dei peptidi HCP digeriti dalla soluzione.
Rispetto ai metodi di filtrazione, la tecnica PMLD non è limitata dalle dimensioni degli HCP rilevati17. I metodi di delezione della proteina A sono specifici per rilevare gli HCP associati agli anticorpi21, mentre l’immunoprecipitazione è limitata agli HCP predefiniti di una particolare linea cellulare (come la linea cellulare dell’ovaio di criceto cinese (CHO)), in cui è stato generato un anticorpo anti-HCP4. Al contrario, la PMLD può essere applicata per rilevare gli HCP da qualsiasi modulo farmacologico e proteine della cellula ospite co-purificate con prodotti farmaceutici di varie linee cellulari. Inoltre, PMLD mostra una migliore sensibilità rispetto ai metodi menzionati 17,18,20,21,24.
Questo approccio può arricchire la concentrazione di HCP di 7000 volte e abbassare il limite di rilevamento a 0,002 ppm28. La configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esistono due versioni di perle di arricchimento proteico disponibili in commercio: una con una capacità inferiore e l’altra con una capacità maggiore (vedi Tabella dei materiali). Entrambe le versioni delle perle di arricchimento contengono dieci preparazioni nella confezione. Le istruzioni del produttore suggeriscono che ogni preparazione del kit di piccola capacità può essere utilizzata per arricchire 10 mg di proteine totali. Tuttavia, per prestazioni ottimali dell’arricchimento di proteine della …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
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