Summary

Analisi delle proteine delle cellule ospiti utilizzando perle di arricchimento accoppiate a digestione limitata

Published: January 19, 2024
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Summary

Viene presentato un protocollo per l’arricchimento delle proteine della cellula ospite (HCP) da prodotti farmaceutici (DP) e la rilevazione di peptidi utilizzando perle di arricchimento del proteoma. Il metodo è dimostrato utilizzando una sostanza farmaceutica (DS) a base di anticorpi monoclonali (mAb) prodotta internamente, che è un materiale di riferimento ben caratterizzato per la valutazione e il confronto di diversi metodi in termini di prestazioni.

Abstract

Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che possono influire negativamente sulle proteine terapeutiche, anche in piccole quantità. Per valutare i potenziali rischi associati ai prodotti farmaceutici, sono stati sviluppati metodi per identificare gli operatori sanitari a bassa abbondanza. Un approccio cruciale per lo sviluppo di un metodo di rilevamento sensibile degli HCP prevede l’arricchimento degli HCP e la contemporanea rimozione degli anticorpi monoclonali (mAb) prima dell’analisi, utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per l’arricchimento delle proteine della cellula ospite utilizzando perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio. Queste perle contengono una libreria diversificata di ligandi esapeptidici con affinità specifiche per diverse proteine. Il protocollo incorpora anche una digestione limitata e il successivo rilevamento dei peptidi utilizzando nano LC-MS/MS. Impiegando queste tecniche, gli HCP con bassa abbondanza possono essere arricchiti di oltre 7000 volte, con un limite di rilevamento impressionante fino a 0,002 ppm. Significativamente, questo protocollo consente il rilevamento di 850 HCP con un alto livello di confidenza utilizzando un anticorpo monoclonale NIST. Inoltre, è progettato per essere facile da usare e include una dimostrazione video per assisterne l’implementazione. Seguendo questi passaggi, i ricercatori possono arricchire e rilevare efficacemente gli operatori sanitari, migliorando la sensibilità e l’accuratezza della valutazione del rischio per i prodotti farmaceutici.

Introduction

Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che vengono rilasciate dalla coltura cellulare dell’organismo ospite e co-purificate con l’anticorpo monoclonale (mAb)1,2,3,4. I livelli di tracce di HCP possono avere un impatto negativo sulla qualità del prodotto farmaceutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, pertanto, è necessario un metodo di analisi HCP sensibile per rilevare gli HCP a livelli da sub-ppm a ppm.

I metodi ortogonali possono essere applicati per rilevare gli HCP in bassa abbondanza. Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è generalmente utilizzato per quantificare gli HCP complessivi e può anche rilevare e quantificare i singoli HCP se sono disponibili gli anticorpi corrispondenti16. Tuttavia, la produzione di anticorpi specifici per l’HCP richiede molto tempo e lavoro. Al contrario, la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) può fornire informazioni complete sui singoli HCP nei prodotti farmaceutici mAb ed è ampiamente applicata per l’identificazione degli HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Sono stati sviluppati diversi metodi per rilevare gli HCP con LC-MS/MS, tra cui la digestione limitata20, la filtrazione 17, la delezione della proteina A21, l’immunoprecipitazione (IP) e l’arricchimento di ProteoMiner (PM)18. La maggior parte dei metodi mira a ridurre la quantità di anticorpi monoclonali e ad arricchire gli HCP prima dell’analisi LC-MS/MS, diminuendo così l’intervallo dinamico tra i peptidi degli anticorpi monoclonali e i peptidi HCP. Questo protocollo presenta un metodo di arricchimento del campione proteomico che combina la tecnologia ProteoMiner e la digestione limitata (PMLD)28. Il principio di arricchimento di ProteoMiner prevede l’utilizzo di perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio contenenti una libreria diversificata di ligandi peptidici combinatori. Questi ligandi si legano specificamente alle proteine sui prodotti anticorpali-farmacologici, consentendo la rimozione delle molecole in eccesso e concentrando le proteine delle cellule ospiti (HCP) a bassa abbondanza sui rispettivi ligandi di affinità. D’altra parte, il principio della digestione limitata prevede l’utilizzo di una bassa concentrazione di tripsina. Questa concentrazione è sufficiente per digerire gli HCP a bassa abbondanza, ma non sufficiente per digerire tutti i farmaci anticorpali. Questo approccio consente il recupero e l’arricchimento dei peptidi HCP digeriti dalla soluzione.

Rispetto ai metodi di filtrazione, la tecnica PMLD non è limitata dalle dimensioni degli HCP rilevati17. I metodi di delezione della proteina A sono specifici per rilevare gli HCP associati agli anticorpi21, mentre l’immunoprecipitazione è limitata agli HCP predefiniti di una particolare linea cellulare (come la linea cellulare dell’ovaio di criceto cinese (CHO)), in cui è stato generato un anticorpo anti-HCP4. Al contrario, la PMLD può essere applicata per rilevare gli HCP da qualsiasi modulo farmacologico e proteine della cellula ospite co-purificate con prodotti farmaceutici di varie linee cellulari. Inoltre, PMLD mostra una migliore sensibilità rispetto ai metodi menzionati 17,18,20,21,24.

Questo approccio può arricchire la concentrazione di HCP di 7000 volte e abbassare il limite di rilevamento a 0,002 ppm28. La configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1.

Protocol

Le abbreviazioni utilizzate nel protocollo sono elencate nella tabella supplementare 1. 1. Preparazione di soluzioni e tamponi NOTA: I dettagli commerciali di tutti i reagenti sono elencati nella Tabella dei materiali. Preparare una soluzione 0,1 M di Tris-HCl, pH 8,0 aggiungendo 1 mL di 1 M Tris-HCl, pH 8,0 in 9 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di vetro e mescolare bene mediante vortex. Conservare…

Representative Results

Questo protocollo ha presentato un flusso di lavoro per la preparazione del campione, denominato arricchimento proteico accoppiato con digestione limitata (PMLD), per l’analisi delle proteine della cellula ospite (HCP) in un campione di anticorpi monoclonali (mAb). La Figura 1 illustra la procedura passo-passo di PMLD. I ricercatori hanno confrontato i risultati dell’analisi HCP utilizzando la digestione diretta (mostrata nel pannello superiore della Figura 2) e PMLD (mostrata nel pannello i…

Discussion

Esistono due versioni di perle di arricchimento proteico disponibili in commercio: una con una capacità inferiore e l’altra con una capacità maggiore (vedi Tabella dei materiali). Entrambe le versioni delle perle di arricchimento contengono dieci preparazioni nella confezione. Le istruzioni del produttore suggeriscono che ogni preparazione del kit di piccola capacità può essere utilizzata per arricchire 10 mg di proteine totali. Tuttavia, per prestazioni ottimali dell’arricchimento di proteine della …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nessuno.

Materials

16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

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Cite This Article
Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

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