Analyse des protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement couplées à une digestion limitée

Les protéines de la cellule hôte (HCP) sont des impuretés qui sont libérées par la culture cellulaire de l’organisme hôte et co-purifiées avec des anticorps monoclonaux (anticorps monoclonaux)1,2,3,4. Des traces de PS peuvent avoir un impact négatif sur la qualité du produit pharmaceutique 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 et, par conséquent^, une méthode d’analyse sensible des PS est souhaitée pour détecter les PS à des niveaux inférieurs au ppm.

Des méthodes orthogonales peuvent être appliquées pour détecter les PS en faible abondance. Le test immuno-enzymatique (ELISA) est généralement utilisé pour quantifier l’ensemble des professionnels de la santé, et il peut également détecter et quantifier les professionnels de la santé individuels si les anticorps correspondants sont disponibles¹⁶. Cependant, la production d’anticorps spécifiques au HCP prend beaucoup de temps et de main-d’œuvre. En revanche, la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) peut fournir des informations complètes sur les HCP individuels dans les produits pharmaceutiques anticlonaux et est largement appliquée pour l’identification des HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20^, 21,22,23,24,25,26,27.

Plusieurs méthodes ont été mises au point pour détecter les professionnels de la santé avec LC-MS/MS, notamment la digestion limitée²⁰, la filtration¹⁷, la délétion de la protéine A²¹, l’immunoprécipitation (IP) et l’enrichissement en protéoMiner (PM)¹⁸. La plupart des méthodes visent à réduire la quantité d’anticorps monoclonaux et à enrichir les professionnels de la santé avant l’analyse LC-MS/MS, diminuant ainsi la plage dynamique entre les peptides anticorps monoclonaux et les peptides de type HCP. Ce protocole présente une méthode d’enrichissement protéomique d’échantillons qui combine la technologie ProteoMiner et la digestion limitée (PMLD)²⁸. Le principe d’enrichissement de ProteoMiner implique l’utilisation de billes d’enrichissement de protéome disponibles dans le commerce contenant une bibliothèque diversifiée de ligands peptidiques combinatoires. Ces ligands se lient spécifiquement aux protéines des anticorps-médicaments, ce qui permet d’éliminer les molécules en excès tout en concentrant les protéines de la cellule hôte (HCP) de faible abondance sur leurs ligands d’affinité respectifs. D’autre part, le principe de la digestion limitée implique l’utilisation d’une faible concentration de trypsine. Cette concentration est suffisante pour digérer les PS de faible abondance, mais pas assez pour digérer tous les produits médicamenteux à base d’anticorps. Cette approche permet la récupération et l’enrichissement des peptides HCP digérés à partir de la solution.

Par rapport aux méthodes de filtration, la technique PMLD n’est pas limitée par la taille des HCP détectés¹⁷. Les méthodes de délétion de la protéine A sont spécifiques à la détection des HCP associés aux anticorps²¹, tandis que l’immunoprécipitation est limitée aux HCP prédéfinis d’une lignée cellulaire particulière (telle que la lignée cellulaire de l’ovaire de hamster chinois (CHO)), où un anticorps anti-HCP a été généré⁴. En revanche, la PMLD peut être appliquée pour détecter les HCP à partir de n’importe quel module médicamenteux et des protéines de cellules hôtes co-purifiées avec des produits médicamenteux provenant de diverses lignées cellulaires. De plus, la PMLD présente une meilleure sensibilité par rapport aux méthodes mentionnées 17,18,20,21,24.

Cette approche permet d’enrichir la concentration de HCP de 7000 fois et d’abaisser la limite de détection à 0,002 ppm²⁸. Le dispositif expérimental est illustré à la figure 1.