Análisis de proteínas de la célula huésped mediante perlas de enriquecimiento junto con digestión limitada

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que se liberan del cultivo celular del organismo huésped y se copurifican con anticuerpos monoclonales (mAb)1,2,3,4. Los niveles traza de HCP pueden afectar negativamente la calidad del producto farmacéutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y, por lo tanto^, se desea un método de análisis de HCP sensible para detectar HCP en niveles inferiores a ppm.

Se pueden aplicar métodos ortogonales para detectar HCP en baja abundancia. El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) se utiliza generalmente para cuantificar los HCP generales, y también puede detectar y cuantificar los HCP individuales si se dispone de los anticuerpos correspondientes¹⁶. Sin embargo, la producción de anticuerpos específicos para el HCP requiere mucho tiempo y mano de obra. Por el contrario, la cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas (LC-MS) puede proporcionar información completa sobre los HCP individuales en los medicamentos mAb y se aplica ampliamente para la identificación de HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20^, 21,22,23,24,25,26,27.

Se han desarrollado varios métodos para detectar HCP con LC-MS/MS, incluyendo la digestión limitada²⁰, la filtración¹⁷, la deleción de la proteína A²¹, la inmunoprecipitación (IP) y el enriquecimiento de ProteoMiner (PM)¹⁸. La mayoría de los métodos tienen como objetivo reducir la cantidad de anticuerpos monoclonales y enriquecer los profesionales de la salud antes del análisis de LC-MS/MS, disminuyendo así el rango dinámico entre los péptidos de anticuerpos monoclonales y los péptidos de los profesionales sanitarios. Este protocolo presenta un método de enriquecimiento proteómico de muestras que combina la tecnología ProteoMiner y la digestión limitada (PMLD)²⁸. El principio de enriquecimiento de ProteoMiner implica el uso de perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles comercialmente que contienen una biblioteca diversa de ligandos peptídicos combinatorios. Estos ligandos se unen específicamente a las proteínas de los productos farmacológicos de anticuerpos, lo que permite la eliminación del exceso de moléculas mientras concentran las proteínas de la célula huésped (HCP) de baja abundancia en sus respectivos ligandos de afinidad. Por otro lado, el principio de digestión limitada implica el uso de una baja concentración de tripsina. Esta concentración es suficiente para digerir los profesionales de la salud de baja abundancia, pero no es suficiente para digerir todos los medicamentos de anticuerpos. Este enfoque permite la recuperación y el enriquecimiento de los péptidos HCP digeridos a partir de la solución.

En comparación con los métodos de filtración, la técnica PMLD no está limitada por el tamaño de los PS detectados¹⁷. Los métodos de deleción de la proteína A son específicos para detectar HCP asociados con anticuerpos²¹, mientras que la inmunoprecipitación se restringe a HCP predefinidos de una línea celular particular (como la línea celular de ovario de hámster chino (CHO)), donde se generó un anticuerpo anti-HCP⁴. Por el contrario, la PMLD se puede aplicar para detectar HCP de cualquier módulo farmacológico y proteínas de la célula huésped copurificadas con productos farmacológicos de varias líneas celulares. Además, la PMLD presenta una mejor sensibilidad en comparación con los métodos mencionados 17,18,20,21,24.

Este enfoque puede enriquecer la concentración de HCP en 7000 veces y reducir el límite de detección a 0,002 ppm²⁸. La configuración experimental se ilustra en la Figura 1.