Summary

Análisis de proteínas de la célula huésped mediante perlas de enriquecimiento junto con digestión limitada

Published: January 19, 2024
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Summary

Se presenta un protocolo para enriquecer proteínas de células huésped (HCP) a partir de productos farmacológicos (DP) y detectar péptidos mediante perlas de enriquecimiento de proteomas. El método se demuestra utilizando una sustancia farmacológica (DS) de anticuerpos monoclonales (mAb) de fabricación propia, que es un material de referencia bien caracterizado para evaluar y comparar diferentes métodos en términos de rendimiento.

Abstract

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que pueden afectar negativamente a las proteínas terapéuticas, incluso en pequeñas cantidades. Para evaluar los riesgos potenciales asociados con los productos farmacéuticos, se han desarrollado métodos para identificar a los profesionales de la salud de baja abundancia. Un enfoque crucial para el desarrollo de un método sensible de detección de HCP consiste en enriquecer a los HCP y, al mismo tiempo, eliminar los anticuerpos monoclonales (mAb) antes del análisis, utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS).

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para enriquecer las proteínas de la célula huésped utilizando perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles en el mercado. Estas perlas contienen una biblioteca diversa de ligandos hexapéptidos con afinidades específicas por diferentes proteínas. El protocolo también incorpora la digestión limitada y la posterior detección de péptidos mediante nano LC-MS/MS. Al emplear estas técnicas, los HCP con baja abundancia se pueden enriquecer más de 7000 veces, lo que resulta en un impresionante límite de detección tan bajo como 0.002 ppm. Cabe destacar que este protocolo permite la detección de 850 profesionales de la salud con un alto nivel de confianza utilizando un mAb del NIST. Además, está diseñado para ser fácil de usar e incluye una demostración en video para ayudar con su implementación. Al seguir estos pasos, los investigadores pueden enriquecer y detectar eficazmente a los profesionales de la salud, mejorando la sensibilidad y la precisión de la evaluación de riesgos de los productos farmacéuticos.

Introduction

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que se liberan del cultivo celular del organismo huésped y se copurifican con anticuerpos monoclonales (mAb)1,2,3,4. Los niveles traza de HCP pueden afectar negativamente la calidad del producto farmacéutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y, por lo tanto, se desea un método de análisis de HCP sensible para detectar HCP en niveles inferiores a ppm.

Se pueden aplicar métodos ortogonales para detectar HCP en baja abundancia. El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) se utiliza generalmente para cuantificar los HCP generales, y también puede detectar y cuantificar los HCP individuales si se dispone de los anticuerpos correspondientes16. Sin embargo, la producción de anticuerpos específicos para el HCP requiere mucho tiempo y mano de obra. Por el contrario, la cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas (LC-MS) puede proporcionar información completa sobre los HCP individuales en los medicamentos mAb y se aplica ampliamente para la identificación de HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Se han desarrollado varios métodos para detectar HCP con LC-MS/MS, incluyendo la digestión limitada20, la filtración17, la deleción de la proteína A21, la inmunoprecipitación (IP) y el enriquecimiento de ProteoMiner (PM)18. La mayoría de los métodos tienen como objetivo reducir la cantidad de anticuerpos monoclonales y enriquecer los profesionales de la salud antes del análisis de LC-MS/MS, disminuyendo así el rango dinámico entre los péptidos de anticuerpos monoclonales y los péptidos de los profesionales sanitarios. Este protocolo presenta un método de enriquecimiento proteómico de muestras que combina la tecnología ProteoMiner y la digestión limitada (PMLD)28. El principio de enriquecimiento de ProteoMiner implica el uso de perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles comercialmente que contienen una biblioteca diversa de ligandos peptídicos combinatorios. Estos ligandos se unen específicamente a las proteínas de los productos farmacológicos de anticuerpos, lo que permite la eliminación del exceso de moléculas mientras concentran las proteínas de la célula huésped (HCP) de baja abundancia en sus respectivos ligandos de afinidad. Por otro lado, el principio de digestión limitada implica el uso de una baja concentración de tripsina. Esta concentración es suficiente para digerir los profesionales de la salud de baja abundancia, pero no es suficiente para digerir todos los medicamentos de anticuerpos. Este enfoque permite la recuperación y el enriquecimiento de los péptidos HCP digeridos a partir de la solución.

En comparación con los métodos de filtración, la técnica PMLD no está limitada por el tamaño de los PS detectados17. Los métodos de deleción de la proteína A son específicos para detectar HCP asociados con anticuerpos21, mientras que la inmunoprecipitación se restringe a HCP predefinidos de una línea celular particular (como la línea celular de ovario de hámster chino (CHO)), donde se generó un anticuerpo anti-HCP4. Por el contrario, la PMLD se puede aplicar para detectar HCP de cualquier módulo farmacológico y proteínas de la célula huésped copurificadas con productos farmacológicos de varias líneas celulares. Además, la PMLD presenta una mejor sensibilidad en comparación con los métodos mencionados 17,18,20,21,24.

Este enfoque puede enriquecer la concentración de HCP en 7000 veces y reducir el límite de detección a 0,002 ppm28. La configuración experimental se ilustra en la Figura 1.

Protocol

Las abreviaturas utilizadas en el protocolo se enumeran en la Tabla Suplementaria 1. 1. Preparación de soluciones y tampones NOTA: Los detalles comerciales de todos los reactivos se enumeran en la Tabla de Materiales. Prepare una solución de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 añadiendo 1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 en 9 ml de agua desionizada en un vial de vidrio y mezcle bien mediante vórtice. Conservar a 4 °C du…

Representative Results

Este protocolo presentó un flujo de trabajo de preparación de muestras, denominado enriquecimiento de proteínas junto con digestión limitada (PMLD), para el análisis de proteínas de la célula huésped (HCP) en una muestra de anticuerpos monoclonales (mAb). La Figura 1 ilustra el procedimiento paso a paso de PMLD. Los investigadores compararon los resultados del análisis de HCP utilizando la digestión directa (que se muestra en el panel superior de la Figura 2) y PMLD (que se muestra…

Discussion

Hay dos versiones de perlas de enriquecimiento de proteínas disponibles comercialmente: una con una capacidad más pequeña y la otra con una capacidad más grande (ver Tabla de materiales). Ambas versiones de las perlas de enriquecimiento contienen diez preparaciones en el paquete. Las instrucciones del fabricante sugieren que cada preparación del kit de pequeña capacidad se puede usar para enriquecer 10 mg de proteína total. Sin embargo, para un rendimiento óptimo del enriquecimiento de proteínas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ninguno.

Materials

16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. . , (2023).
  30. Uniprot2. . , (2023).

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Cite This Article
Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

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