Summary

تحليل بروتين الخلية المضيفة باستخدام حبات التخصيب إلى جانب الهضم المحدود

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

يتم تقديم بروتوكول لإثراء بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) من المنتجات الدوائية (DP) والكشف عن الببتيدات باستخدام حبات إثراء البروتين. يتم عرض الطريقة باستخدام مادة دواء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) المصنعة داخليا (DS) ، وهي مادة مرجعية جيدة المواصفات لتقييم ومقارنة الطرق المختلفة من حيث الأداء.

Abstract

بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) هي شوائب يمكن أن تؤثر سلبا على البروتينات العلاجية ، حتى بكميات صغيرة. لتقييم المخاطر المحتملة المرتبطة بالمنتجات الدوائية ، تم تطوير طرق لتحديد HCPs منخفضة الوفرة. يتضمن النهج الحاسم لتطوير طريقة حساسة للكشف عن HCP إثراء HCPs مع إزالة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في نفس الوقت قبل التحليل ، باستخدام قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS).

يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإثراء بروتينات الخلية المضيفة باستخدام حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا. تحتوي هذه الخرزات على مكتبة متنوعة من روابط سداسي الببتيد ذات صلات محددة للبروتينات المختلفة. يتضمن البروتوكول أيضا الهضم المحدود والكشف اللاحق عن الببتيد باستخدام NANO LC-MS / MS. من خلال استخدام هذه التقنيات ، يمكن إثراء HCPs ذات الوفرة المنخفضة بأكثر من 7000 ضعف ، مما يؤدي إلى حد اكتشاف مثير للإعجاب يصل إلى 0.002 جزء في المليون. بشكل ملحوظ ، يتيح هذا البروتوكول اكتشاف 850 HCPs بمستوى عال من الثقة باستخدام NIST mAb. علاوة على ذلك ، تم تصميمه ليكون سهل الاستخدام ويتضمن عرضا توضيحيا بالفيديو للمساعدة في تنفيذه. باتباع هذه الخطوات ، يمكن للباحثين إثراء واكتشاف HCPs بشكل فعال ، مما يعزز حساسية ودقة تقييم المخاطر للمنتجات الدوائية.

Introduction

بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) هي شوائب يتم إطلاقها من زراعة الخلايا للكائن الحي المضيف ويتم تنقيتها بشكل مشترك باستخدام الجسم المضاد وحيد النسيلة (mAb)1،2،3،4. يمكن أن تؤثر مستويات التتبع من HCPs سلبا على جودة منتج الدواء5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، وبالتالي ، فإن طريقة تحليل HCP الحساسة مطلوبة للكشف عن HCPs في مستويات جزء في المليون إلى جزء في المليون.

يمكن تطبيق طرق متعامدة للكشف عن HCPs بوفرة منخفضة. يستخدم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) بشكل عام لتحديد كمية HCPs الإجمالية ، ويمكنه أيضا اكتشاف وقياس HCPs الفردية إذا كانت الأجسام المضادة المقابلة متوفرة16. ومع ذلك ، فإن إنتاج الأجسام المضادة الخاصة ب HCP يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة. في المقابل ، يمكن أن توفر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي (LC-MS) معلومات شاملة حول HCPs الفردية في منتجات الأدوية mAb ويتم تطبيقها على نطاق واسع لتحديد HCP4،7،9،10،12،13،14،15،17،18،19،20 ، 21,22,23,24,25,26,27.

تم تطوير عدة طرق للكشف عن HCPs مع LC-MS / MS ، بما في ذلك الهضمالمحدود 20 ، والترشيح17 ، وحذف البروتين A21 ، والترسيب المناعي (IP) ، وتخصيب ProteoMiner (PM) 18. تهدف معظم الطرق إلى تقليل كمية mAb وإثراء HCPs قبل تحليل LC-MS / MS ، وبالتالي تقليل النطاق الديناميكي بين ببتيدات mAb وببتيدات HCP. يقدم هذا البروتوكول طريقة إثراء عينة بروتينية تجمع بين تقنية ProteoMiner والهضم المحدود (PMLD)28. يتضمن مبدأ إثراء ProteoMiner استخدام حبات إثراء البروتين المتاحة تجاريا والتي تحتوي على مكتبة متنوعة من روابط الببتيد التوافقية. ترتبط هذه الروابط على وجه التحديد بالبروتينات الموجودة على منتجات أدوية الأجسام المضادة ، مما يسمح بإزالة الجزيئات الزائدة مع تركيز بروتينات الخلايا المضيفة منخفضة الوفرة (HCPs) على روابط التقارب الخاصة بها. من ناحية أخرى ، يتضمن مبدأ الهضم المحدود استخدام تركيز منخفض من التربسين. هذا التركيز كاف لهضم HCPs منخفضة الوفرة ولكنه غير كاف لهضم جميع منتجات أدوية الأجسام المضادة. يتيح هذا النهج استعادة وإثراء ببتيدات HCP المهضومة من المحلول.

بالمقارنة مع طرق الترشيح ، لا تقتصر تقنية PMLD على حجم HCPs المكتشفة17. طرق حذف البروتين أ خاصة بالكشف عن HCPs المرتبطة بالأجسام المضادة21 ، بينما يقتصر الترسيب المناعي على HCPs المحددة مسبقا من خط خلية معين (مثل خط خلية مبيض الهامستر الصيني (CHO)) ، حيث تم إنشاء جسم مضاد مضاد ل HCP4. في المقابل ، يمكن تطبيق PMLD للكشف عن HCPs من أي وحدات دوائية وبروتينات الخلايا المضيفة المنقاة بشكل مشترك مع منتجات الأدوية من خطوط الخلايا المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر PMLD حساسية أفضل مقارنة بالطرق المذكورة17،18،20،21،24.

يمكن لهذا النهج إثراء تركيز HCP بمقدار 7000 ضعف وخفض حد الكشف إلى 0.002 جزء في المليون28. يوضح الشكل 1 الإعداد التجريبي.

Protocol

الاختصارات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في الجدول التكميلي 1. 1. إعداد الحلول والمخازن المؤقتة ملاحظة: يتم سرد التفاصيل التجارية لجميع الكواشف في جدول المواد. قم بإعداد محلول 0.1 M Tris-HCl ، pH 8.0 بإضافة 1 مل من 1 M Tris-HCl ، ودرجة الحموض?…

Representative Results

قدم هذا البروتوكول سير عمل لإعداد العينة ، يسمى إثراء البروتين إلى جانب الهضم المحدود (PMLD) ، لتحليل بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) في عينة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb). يوضح الشكل 1 الإجراء التدريجي ل PMLD. قارن الباحثون نتائج تحليل HCP باستخدام الهضم المباشر (كما هو موضح ف…

Discussion

هناك نسختان من حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا: واحدة بسعة أصغر والأخرى بسعة أكبر (انظر جدول المواد). يحتوي كلا الإصدارين من حبات التخصيب على عشرة تحضيرات في العبوة. تشير تعليمات الشركة المصنعة إلى أنه يمكن استخدام كل تحضير من مجموعة السعة الصغيرة لإثراء 10 ملغ من البروتين الكل?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

اي.

Materials

16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. . , (2023).
  30. Uniprot2. . , (2023).

Play Video

Cite This Article
Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

View Video