يتم تقديم بروتوكول لإثراء بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) من المنتجات الدوائية (DP) والكشف عن الببتيدات باستخدام حبات إثراء البروتين. يتم عرض الطريقة باستخدام مادة دواء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) المصنعة داخليا (DS) ، وهي مادة مرجعية جيدة المواصفات لتقييم ومقارنة الطرق المختلفة من حيث الأداء.
بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) هي شوائب يمكن أن تؤثر سلبا على البروتينات العلاجية ، حتى بكميات صغيرة. لتقييم المخاطر المحتملة المرتبطة بالمنتجات الدوائية ، تم تطوير طرق لتحديد HCPs منخفضة الوفرة. يتضمن النهج الحاسم لتطوير طريقة حساسة للكشف عن HCP إثراء HCPs مع إزالة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في نفس الوقت قبل التحليل ، باستخدام قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS).
يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإثراء بروتينات الخلية المضيفة باستخدام حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا. تحتوي هذه الخرزات على مكتبة متنوعة من روابط سداسي الببتيد ذات صلات محددة للبروتينات المختلفة. يتضمن البروتوكول أيضا الهضم المحدود والكشف اللاحق عن الببتيد باستخدام NANO LC-MS / MS. من خلال استخدام هذه التقنيات ، يمكن إثراء HCPs ذات الوفرة المنخفضة بأكثر من 7000 ضعف ، مما يؤدي إلى حد اكتشاف مثير للإعجاب يصل إلى 0.002 جزء في المليون. بشكل ملحوظ ، يتيح هذا البروتوكول اكتشاف 850 HCPs بمستوى عال من الثقة باستخدام NIST mAb. علاوة على ذلك ، تم تصميمه ليكون سهل الاستخدام ويتضمن عرضا توضيحيا بالفيديو للمساعدة في تنفيذه. باتباع هذه الخطوات ، يمكن للباحثين إثراء واكتشاف HCPs بشكل فعال ، مما يعزز حساسية ودقة تقييم المخاطر للمنتجات الدوائية.
بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) هي شوائب يتم إطلاقها من زراعة الخلايا للكائن الحي المضيف ويتم تنقيتها بشكل مشترك باستخدام الجسم المضاد وحيد النسيلة (mAb)1،2،3،4. يمكن أن تؤثر مستويات التتبع من HCPs سلبا على جودة منتج الدواء5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، وبالتالي ، فإن طريقة تحليل HCP الحساسة مطلوبة للكشف عن HCPs في مستويات جزء في المليون إلى جزء في المليون.
يمكن تطبيق طرق متعامدة للكشف عن HCPs بوفرة منخفضة. يستخدم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) بشكل عام لتحديد كمية HCPs الإجمالية ، ويمكنه أيضا اكتشاف وقياس HCPs الفردية إذا كانت الأجسام المضادة المقابلة متوفرة16. ومع ذلك ، فإن إنتاج الأجسام المضادة الخاصة ب HCP يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة. في المقابل ، يمكن أن توفر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي (LC-MS) معلومات شاملة حول HCPs الفردية في منتجات الأدوية mAb ويتم تطبيقها على نطاق واسع لتحديد HCP4،7،9،10،12،13،14،15،17،18،19،20 ، 21,22,23,24,25,26,27.
تم تطوير عدة طرق للكشف عن HCPs مع LC-MS / MS ، بما في ذلك الهضمالمحدود 20 ، والترشيح17 ، وحذف البروتين A21 ، والترسيب المناعي (IP) ، وتخصيب ProteoMiner (PM) 18. تهدف معظم الطرق إلى تقليل كمية mAb وإثراء HCPs قبل تحليل LC-MS / MS ، وبالتالي تقليل النطاق الديناميكي بين ببتيدات mAb وببتيدات HCP. يقدم هذا البروتوكول طريقة إثراء عينة بروتينية تجمع بين تقنية ProteoMiner والهضم المحدود (PMLD)28. يتضمن مبدأ إثراء ProteoMiner استخدام حبات إثراء البروتين المتاحة تجاريا والتي تحتوي على مكتبة متنوعة من روابط الببتيد التوافقية. ترتبط هذه الروابط على وجه التحديد بالبروتينات الموجودة على منتجات أدوية الأجسام المضادة ، مما يسمح بإزالة الجزيئات الزائدة مع تركيز بروتينات الخلايا المضيفة منخفضة الوفرة (HCPs) على روابط التقارب الخاصة بها. من ناحية أخرى ، يتضمن مبدأ الهضم المحدود استخدام تركيز منخفض من التربسين. هذا التركيز كاف لهضم HCPs منخفضة الوفرة ولكنه غير كاف لهضم جميع منتجات أدوية الأجسام المضادة. يتيح هذا النهج استعادة وإثراء ببتيدات HCP المهضومة من المحلول.
بالمقارنة مع طرق الترشيح ، لا تقتصر تقنية PMLD على حجم HCPs المكتشفة17. طرق حذف البروتين أ خاصة بالكشف عن HCPs المرتبطة بالأجسام المضادة21 ، بينما يقتصر الترسيب المناعي على HCPs المحددة مسبقا من خط خلية معين (مثل خط خلية مبيض الهامستر الصيني (CHO)) ، حيث تم إنشاء جسم مضاد مضاد ل HCP4. في المقابل ، يمكن تطبيق PMLD للكشف عن HCPs من أي وحدات دوائية وبروتينات الخلايا المضيفة المنقاة بشكل مشترك مع منتجات الأدوية من خطوط الخلايا المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر PMLD حساسية أفضل مقارنة بالطرق المذكورة17،18،20،21،24.
يمكن لهذا النهج إثراء تركيز HCP بمقدار 7000 ضعف وخفض حد الكشف إلى 0.002 جزء في المليون28. يوضح الشكل 1 الإعداد التجريبي.
هناك نسختان من حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا: واحدة بسعة أصغر والأخرى بسعة أكبر (انظر جدول المواد). يحتوي كلا الإصدارين من حبات التخصيب على عشرة تحضيرات في العبوة. تشير تعليمات الشركة المصنعة إلى أنه يمكن استخدام كل تحضير من مجموعة السعة الصغيرة لإثراء 10 ملغ من البروتين الكل?…
The authors have nothing to disclose.
اي.
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
Milli-Q | Millpore | 30035 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |