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Chemistry

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

Published: January 19, 2024
doi:
10.3791/65544
, ,
1Analytical Chemistry,Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

의약품(DP)에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 농축하고 단백질체 농축 비드를 사용하여 펩타이드를 검출하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 자체 제조한 단클론 항체(mAb) 원료의약품(DS)을 사용하여 시연되며, 이는 성능 측면에서 다양한 방법을 평가하고 비교하기 위한 잘 특성화된 표준 물질입니다.

Abstract

숙주 세포 단백질(HCP)은 소량이라도 치료용 단백질에 악영향을 미칠 수 있는 불순물입니다. 의약품과 관련된 잠재적 위험을 평가하기 위해 저농도 HCP를 식별하는 방법이 개발되었습니다. 민감한 HCP 검출 방법을 개발하기 위한 중요한 접근법은 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 활용하여 분석 전에 단클론 항체(mAb)를 제거하는 동시에 HCP를 농축하는 것입니다.

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질체 농축 비드를 사용하여 숙주 세포 단백질을 농축하기 위한 자세한 지침을 제공합니다. 이 비드에는 다양한 단백질에 대한 특정 친화력을 가진 다양한 헥사펩타이드 리간드 라이브러리가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 또한 나노 LC-MS/MS를 사용하여 제한된 분해 및 후속 펩타이드 검출을 통합합니다. 이러한 기술을 사용하면 존재비가 낮은 HCP를 7,000배 이상 농축할 수 있으며, 그 결과 0.002ppm의 놀라운 검출 한계를 달성할 수 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜을 통해 NIST mAb를 사용하여 높은 수준의 신뢰도로 850개의 HCP를 검출할 수 있다는 것입니다. 또한 사용자 친화적으로 설계되었으며 구현을 지원하는 비디오 데모가 포함되어 있습니다. 이러한 단계를 수행함으로써 연구자들은 HCP를 효과적으로 농축하고 검출하여 의약품에 대한 위험 평가의 민감도와 정확성을 향상시킬 수 있습니다.

Introduction

숙주 세포 단백질(HCP)은 숙주 유기체의 세포 배양에서 방출되고 단클론 항체(mAb)1,2,3,4와 함께 공동 정제되는 불순물입니다. HCP의 미량 수준은 의약품 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 ppm 미만에서 ppm 수준의 HCP를 검출하기 위해 민감한 HCP 분석 방법이 필요합니다.

직교 방법을 적용하여 HCP를 소량 검출할 수 있습니다. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)은 일반적으로 전체 HCP를 정량화하는 데 사용되며, 해당 항체를 사용할 수 있는 경우 개별 HCP를 검출하고 정량화할 수도 있습니다16. 그러나 HCP 특이적 항체의 생산은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 대조적으로, 질량분석법(LC-MS)과 결합된 액체 크로마토그래피는 mAb 의약품의 개별 HCP에 대한 포괄적인 정보를 제공할 수 있으며 HCP 식별에 널리 적용됩니다 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27입니다.

LC-MS/MS를 가진 HCP를 검출하기 위해 제한된 분해20, 여과17, 단백질 A 결실21, 면역침전(IP) 및 ProteoMiner 농축(PM)18 등 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 대부분의 분석법은 LC-MS/MS 분석 전에 mAb의 양을 줄이고 HCP를 농축하여 mAb 펩타이드와 HCP 펩타이드 사이의 동적 범위를 줄이는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 ProteoMiner 기술과 제한된 분해(PMLD)를 결합한 단백질체 시료 농축 분석법을 제시합니다28. ProteoMiner 농축 원리는 다양한 조합 펩타이드 리간드 라이브러리를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 단백질체 농축 비드를 사용하는 것을 포함합니다. 이러한 리간드는 항체-의약품의 단백질에 특이적으로 결합하여 과잉 분자를 제거하는 동시에 저농도 숙주 세포 단백질(HCP)을 각각의 친화성 리간드에 집중시킵니다. 반면에, 제한된 소화의 원리는 낮은 농도의 트립신을 사용하는 것을 포함합니다. 이 농도는 소량의 HCP를 소화하기에는 충분하지만 모든 항체 의약품을 소화하기에는 충분하지 않습니다. 이 접근법은 용액에서 분해된 HCP 펩타이드의 회수 및 농축을 가능하게 합니다.

여과 방법과 비교하여, PMLD 기법은 검출된 HCP의 크기에 의해 제한되지 않는다17. 단백질 A 결실 방법은 항체와 관련된 HCP를 검출하는 데 특이적이며,21 면역침전은 항 HCP 항체가 생성된 특정 세포주(예: 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주)에서 사전 정의된 HCP로 제한됩니다4. 대조적으로, PMLD는 다양한 세포주의 의약품과 함께 정제된 모든 약물 모듈 및 숙주 세포 단백질에서 HCP를 검출하는 데 적용할 수 있습니다. 또한, PMLD는 언급된 방법(17,18,20,21,24)에 비해 더 나은 감도를 나타낸다.

이 접근법은 HCP 농도를 7000배까지 풍부하게 하고 검출 한계를 0.002ppm28로 낮출 수 있습니다. 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다.

Protocol

프로토콜에 사용된 약어는 보충 표 1에 나열되어 있습니다. 1. 용액 및 완충액의 준비 알림: 모든 시약의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다. 유리 바이알에 8.0 M Tris-HCl, pH 1 1mL의 탈 이온수, pH 8.0을 첨가하여 pH 8.0 M Tris-HCl, pH 9 용액을 준비하고 소용돌이 치면서 잘 혼합합니다. 4 °C에서 최대 3개월…

Representative Results

이 프로토콜은 단클론 항체(mAb) 샘플에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 분석하기 위해 제한된 분해(PMLD)와 결합된 단백질 농축(protein enrichment)이라고 하는 샘플 전처리 워크플로우를 제시했습니다. 그림 1 은 PMLD의 단계별 절차를 보여줍니다. 연구원들은 직접 분해( 그림 2의 상단 패널에 표시)와 PMLD( 그림 2의 하단 패널에 표시)를 사용한…

Discussion

시판되는 단백질 농축 비드에는 두 가지 버전이 있습니다: 하나는 더 작은 용량이고 다른 하나는 더 큰 용량입니다( 재료 표 참조). 두 가지 버전의 농축 비드에는 패키지에 10개의 프렙이 포함되어 있습니다. 제조업체의 지침에 따르면 소용량 키트의 각 준비는 총 단백질 10mg을 농축하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DS에서 숙주 세포 단백질(HCP) 농축을 최적으로 수행하려면 각 분취?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

없음.

Materials

16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 
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References

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Host Cell ProteinHCP AnalysisProteome Enrichment BeadsLimited DigestionDynamic RangeProteoMiner TechnologyNano LC-MS/MSMonoclonal AntibodyTherapeutic ProteinsImpuritiesRisk Assessment

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Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).
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