Trasplante hepático ortotópico exitoso en ratones mediante angiografía por microtomografía computarizada

Los ratones machos C57BL/6J (30 g de peso corporal) se alojaron en condiciones libres de patógenos en el Centro de Animales del Hospital Infantil Nacional. Todos los procedimientos se realizaron de manera humanitaria de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso Humanitario de Animales de Laboratorio de los NIH y el Consejo Nacional de Investigación y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil Nacional (Protocolo AR17-00045 de la IACUC). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y equipos utilizados en este protocolo. 1. Configuración inicial para la cirugía de trasplante Instale dispositivos quirúrgicos.Instale dispositivos de monitoreo quirúrgico (es decir, dispositivo de monitoreo de frecuencia cardíaca, oxímetro de pulso, sistema de monitoreo modular) y máquinas de anestesia. Si está disponible, encienda la tabla de calentamiento quirúrgico a 42 °C. Asegúrese de que las máquinas de ventilación y anestesia estén encendidas para calentar el evaporador de isoflurano. Llene el depósito de anestesia con 30 ml de isoflurano líquido y asegúrese de que la máquina del ventilador esté conectada al oxígeno.NOTA: En este protocolo, no intubamos al animal; Utilice únicamente un cono de nariz para la oxigenación. Registre el peso corporal de los ratones receptores y donantes. Encienda el microscopio quirúrgico de alta potencia y ajuste la altura y el enfoque según las preferencias del cirujano. Asegúrese de que los dispositivos quirúrgicos restantes estén encendidos (es decir, el dispositivo de electrocauterización). Prepare y coloque los instrumentos quirúrgicos, así como las bridas quirúrgicas de nailon 10-0 (Figura 2).NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 30 min. Además, diferentes configuraciones de instrumentos quirúrgicos podrían ser igualmente efectivas. Prepare los manguitos para los stents de la vena porta (VP) y del conducto biliar común (CBD) (Figura 3). Coloque el angiocatéter, así como el PE10, sobre una superficie estéril bajo el microscopio de alta potencia. Con una cuchilla quirúrgica #11, corte el angiocatéter para formar un manguito de 1,5 mm de largo con una lengüeta de aproximadamente 0,75 mm en la parte superior del cuerpo del manguito; corte el tubo de polietileno (PE10) a 2,5 mm de longitud. Guarde los manguitos y el stent en solución salina estéril hasta que estén listos para su uso.NOTA: Este modelo de trasplante utiliza un angiocatéter de 20 G para hacer manguitos para la reconstrucción de VP, así como un tubo de polietileno 10 (PE10) para la reconstrucción del CBD. Todas las demás anastomosis están cosidas a mano. Preparar soluciones. Prepare una inyección de heparina que se administrará a 100 U en 0,5 ml de solución de histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK). Almacene solución salina, solución salina heparina-solución salina, PBS y solución de conservación HTK en hielo. 2. Obtención de ratones donantes Inducir la anestesia en el ratón donante colocándolo en una cámara de inhalación de isoflurano. Asegúrese de que la concentración de isoflurano sea de aproximadamente 2,5% con un flujo de oxígeno de 2 ml/min. Espere 5 minutos para que se desarrolle un plano quirúrgico de anestesia. Para asegurar el nivel adecuado de anestesia, pellizque el ratón con los dedos del pie para provocar una reacción; La falta de reacción indica que se ha alcanzado el nivel adecuado de anestesia. Afeitar el abdomen del ratón con una maquinilla electrónica y colocarlo en posición supina sobre la tabla de calentamiento. Limpie el abdomen con povidona yodada, luego etanol al 70%. Coloque ungüento oftálmico debajo de los ojos de los ratones para evitar la sequedad. Coloque el ratón bajo el microscopio de alta potencia y manténgalo bajo anestesia mediante una inhalación de isoflurano de una concentración del 2% con un flujo de oxígeno de 2 ml/min. Realizar una laparotomía de línea media con un par de tijeras (preferencia del cirujano) desde la apófisis xifoides hasta la sínfisis púbica. A continuación, realice una incisión transversal adicional para crear un patrón “en forma de cruz” inferior a las costillas. Con pinzas hemostáticas para mosquitos, retraiga la apófisis xifoides para lograr una exposición adecuada del contenido abdominal.NOTA: Los fórceps se pueden asegurar según la preferencia del cirujano. Eviscerar los intestinos y colocarlos en el lado izquierdo de la cavidad abdominal en una esponja de gasa húmeda. Moviliza el hígado derribando todas las uniones ligamentosas. Exponga la arteria hepática (pHA) adecuada. Esqueletizar el vaso con pinzas curvas y ligarlo con una sutura de nailon 10-0. Disecciona toda la longitud del CBD usando una combinación de disección afilada y roma. Realice una ductotomía (lo suficientemente grande para el stent de CBD) lo más cerca posible del borde superior del páncreas para obtener una longitud adecuada para su uso futuro (~ 1 cm desde el borde inferior del hígado). Inserte el stent del conducto biliar en el CBD con pinzas finas y asegúrelo con una sutura de nailon 10-0. Lime el aspecto distal del CBD con una sutura de nailon 10-0 (Figura 4). Retraiga el lóbulo hepático derecho hacia el xifoides con una esponja de gasa húmeda y exponga la VCI. Movilizar la VCI infrahepática (IHIVC) lejos del retroperitoneo y cauterizar la vena suprarrenal derecha con un dispositivo de cauterización portátil (ver Tabla de materiales). Diseccionar la arteria y vena renal derecha y ligar con nailon 7-0 y 10-0, respectivamente. Cortar la vena y arteria renal derecha y las inserciones ligamentosas restantes. Por último, extirpa el riñón derecho.NOTA: Esto se hace para tener una mejor exposición cuando finalmente se corta el IHIVC. Inyectar los 0,5 ml de HTK frío con solución de heparina 100 U a través del PV con una aguja de 30 G. Espere 1 minuto para que la heparina se distribuya sistemáticamente. Corta la vena porta justo por encima de la vena esplénica y la vena mesentérica superior. Inyecte lentamente la solución fría de conservación de HTK con heparina en la IHIVC con una aguja de 30 G para perfundir el hígado del donante. Deje de inyectar la solución una vez que el fluido proveniente de la fotovoltaica esté limpio. Una vez completada la inyección, coloque una micropinza en la IHIVC justo por encima de la vena renal derecha y corte justo por debajo de la pinza. Una vez completado este paso, apague el ventilador y detenga el isoflurano ya que el animal acaba de ser sacrificado. Cortar el CBD distalmente al stent que se colocó previamente en el paso 2.7. Además, identifique el conducto cístico y lige el conducto con una sutura de nailon 10-0. A continuación, agarre la cúpula de la vesícula biliar con un par de pinzas y diseccione la fosa de la vesícula biliar utilizando una combinación de disección aguda y roma. Una vez que la vesícula biliar esté adecuadamente movilizada, con unas tijeras de resorte, complete la colecistectomía cortando el conducto cístico por encima de la sutura colocada anteriormente. Retraer el hígado inferiormente para exponer la VCI suprahepática (SHIVC). Cortar el SHIVC prestando especial atención para dar una longitud adecuada a la anastomosis en el animal receptor. Diseccionar las uniones ligamentosas adicionales libres al hígado y entregar el hígado del donante ex vivo y colocar el órgano en un recipiente con solución salina fría. 3. Preparación de la mesa trasera del aloinjerto hepático Coloque hielo en un recipiente aislado y coloque una placa de Petri sobre el lecho de hielo. Llene la placa de Petri con solución salina fría. Coloque el aloinjerto de hígado en la placa de modo que la superficie visceral quede expuesta. Coloque el VP a través del manguito previamente seleccionado y everta la vena de modo que la superficie endotelial interna quede expuesta. Asegure el manguito con una sutura de nailon 10-0. Asegúrese de que la sutura se encuentre dentro de las ranuras del manguito para obtener los mejores resultados (Figura 5). Ajuste el aloinjerto hepático para exponer el SHIVC y coloque dos 8-0 Suturas de nylon a las 3′ y a las 9 horas de orientación, respectivamente, para una eventual anastomosis en el animal receptor. Ajuste el aloinjerto hepático nuevamente para exponer el IHIVC y coloque dos 8-0 Suturas de nylon a las 3′ y a las 9 horas de orientación, respectivamente, para una eventual anastomosis en el animal receptor. 4. Operación del destinatario NOTA: Como se trata de una operación estéril, utilice guantes y equipo de protección personal adecuado y administre antibióticos. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea como analgesia preoperatoria en el momento de la cirugía. Exponer la pHA como en la operación donante; Utilice únicamente una laparotomía de la línea media en lugar de la incisión abdominal descrita anteriormente. Movilizar el hígado y cortar todas las uniones ligamentosas. Además, ligar los vasos frénicos y paraesofágicos izquierdos con sutura de nylon 10-0. Retraer el hígado inferiormente y diseccionar el SHIVC del retroperitoneo. A continuación, retraiga el hígado superiormente y diseccione el IHIVC del retroperitoneo. Cauterizar las venas pequeñas de puente y las venas lumbares según sea necesario utilizando la misma técnica descrita anteriormente. Cauterice la vena suprarrenal derecha con cauterio manual y exponga el hilio hepático. Ligue el pHA con sutura de nailon 10-0. A continuación, diseccione el CBD libre del PV y lige el CBD con una sutura 7-0 cerca de la bifurcación del CBD para dar una longitud adecuada para la anastomosis del CBD. Utilice una micropinza para pinzar la VCI infrahepática y ligar temporalmente la VP con una sutura 7-0. Iniciar la fase anhepática. Suspenda la inhalación de isoflurano.NOTA: Después de pinzar la vena porta y la VCI, el retorno venoso hepático se bloquea completamente en la etapa anhepática. El anestésico inhalado isoflurano es metabolizado por el hígado; Por lo tanto, su inhalación se detiene momentáneamente ya que la acumulación puede provocar un colapso cardiorrespiratorio. A través de la PV del hígado nativo, inyecte 0,5 ml de solución salina de heparina con una aguja de 30 G para enjuagar el órgano. Coloque pinzas microvasculares en el SHIVC y el IHIVC lo más proximal y distalmente posible para dejar una longitud adecuada para la anastomosis. Corte el SHIVC, IHIVC, PV nativo (cerca de la sutura colocada previamente) y cualquier unión ligamentosa restante al hígado nativo del receptor y entregue el hígado nativo ex vivo.NOTA: La pinza IHIVC debe estar por encima de la vena renal derecha. Coloque el aloinjerto hepático del donante dentro de la cavidad abdominal y retraiga el hilio del aloinjerto del donante para exponer la VP. Enjuague tanto al donante como a la VP nativa con 0,5 ml de solución salina de heparina con una aguja de 30 G para desairear los vasos y evitar la embolia gaseosa. A continuación, se inserta el manguito de PV del donante previamente realizado en la luz del PV hepático receptor y, si es necesario, se colocan suturas atirantadas para ayudar a la anastomosis (sutura 8-0). Asegurar la anastomosis con sutura 7-0 (Figura 6). Gira la tabla 180°. Realizar una anastomosis cosida a mano con sutura de nylon 10-0 con el donante y SHIVC nativo. Después de completar la anastomosis de la pared posterior, enjuague con 0,5 ml de solución salina de heparina para eliminar el aire y evitar la embolia gaseosa. Anastomosis completa de la pared superior (Figura 7). Retire primero la sutura de ligadura de PV; luego, retire las pinzas vasculares del SHIVC para comenzar la reperfusión. Finalizar la fase anhepática y reiniciar la inhalación de isoflurano. Realizar la anastomosis cosida a mano con sutura de nylon 10-0, de la misma manera que para la anastomosis SHIVC, para reconstruir la IHIVC. Después de completar la reconstrucción, retire la micropinza del IHIVC nativo y donante para reperfundir (Figura 8). Realizar la anastomosis de CBD creando una ductotomía en el receptor de CBD cerca de la sutura previamente colocada. Inserte el stent en el CBD donante en el lumen de CBD del receptor y asegure la anastomosis con sutura 10-0 (Figura 9). Irrigar la cavidad abdominal con 1 mL de solución salina; Revise la hemostasia y cauterice los vasos sanguíneos sangrantes restantes. Cierre la incisión abdominal en dos capas utilizando sutura 6-0. Coloque al animal en una incubadora caliente (42 °C) para su recuperación y no deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia y la actividad suficiente. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea después de la cirugía y continuar la administración cada 8 a 12 horas durante 48 horas después de la cirugía. Además, administre carprofeno (0,2 ml disuelto en 400 ml de agua) a través de la botella de agua del animal receptor hasta 7 días después de la cirugía. Observe al animal receptor durante 4-5 h y, una vez que se haya recuperado por completo, devuélvalo al lugar de alojamiento, ya que ahora es seguro estar con otros animales.NOTA: Los analgésicos y antibióticos se pueden administrar según las recomendaciones del comité local de ética animal. 5. Imágenes de angiografía por microtomografía computarizada de ratón Después de observar al ratón durante el intervalo de estudio predeterminado, prepare al ratón para evaluar la permeabilidad del aloinjerto mediante angiografía por microTC. Asegúrese de que las máquinas de ventilación y anestesia estén encendidas para calentar el evaporador de isoflurano. Llene el depósito de anestesia con 30 ml de isoflurano líquido y asegúrese de que la máquina del ventilador esté conectada al oxígeno. Encienda el escáner microCT y asegúrese de que todo el software funcione correctamente. Inicie el software de adquisición en el sistema de escáner microCT. En el monitor de la unidad de microCT, haga clic en Initialize system (Inicializar sistema ) y elija el modo de exploración por TC. Expulsar la cama; Coloque la cama del ratón y bloquéela. Encienda la placa de calentamiento a 42 °C para la jaula de recuperación. Llene una jeringa de 1 ml con 100 μl de agente de contraste para TC. Coloque una aguja de calibre 30 para la futura administración intravenosa de contraste. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa. Coloque un ratón en el sistema de sujeción de la vena de la cola. Una vez que el ratón esté completamente dentro del sistema de retención, cierre la puerta del sistema, deje que la cola caiga verticalmente y límpiela cuidadosamente con una solución de alcohol (etanol al 70%).NOTA: El éxito en la canulación de la vena de la cola se puede aumentar calentando la cola del animal sosteniéndola con una mano enguantada durante varios minutos. Sujete la cola hacia la cara distal y coloque dos dedos (índice y medio) alrededor de la cola proximal al lugar de inyección previsto. Coloque la cara distal de la cola (debajo del sitio de la inyección) entre el pulgar y el anular. Con ambos pares de dedos, aplique presión ligeramente e inserte la aguja en la vena a poca profundidad, asegurándose de que la jeringa y la aguja estén paralelas a la cola. Mientras libera la presión del dedo índice en la cola proximal, administre por vía intravenosa el agente de contraste de la TC. Evite la aspiración con la jeringa, ya que esto puede hacer que la vena colapse.NOTA: No se debe sentir resistencia durante la inyección si la aguja está colocada adecuadamente en la vena. Si hay resistencia, retire la aguja y vuelva a insertarla por encima del sitio original de la inyección. Si la canulación de la vena falla incluso después de dos intentos, reemplace la aguja. Después de inyectar con éxito el contraste y retirar la aguja, aplique una compresión suave en el lugar de la inyección con una gasa estéril para detener el sangrado. Transfiera el ratón a la cámara de inhalación de isoflurano y ajuste la concentración al 2,5% con un flujo de oxígeno de 2 ml/min y espere 3-4 min. Una vez que se haya establecido un plano de anestesia, transfiera rápidamente el ratón a la cama del escáner de microTC y colóquelo en posición prona sobre la mesa del escáner (Figura 10). Cubra los ojos del animal con la cantidad adecuada de ungüento oftálmico. Coloque el cono de la nariz adecuadamente sobre el animal y asegúrese de que el aire y el isoflurano fluyan correctamente a través del cono de la nariz. Utilice los mismos parámetros de anestesia descritos anteriormente (paso 5.12). Lubrique e inserte una sonda de temperatura rectal para monitorear continuamente la temperatura corporal del animal durante la toma de imágenes. Coloque un respirador en contacto con el ratón. Use cinta adhesiva para colocar una almohadilla de ECG en las extremidades delanteras izquierdas, derechas e izquierdas. Use gel de ultrasonido para mejorar la señal entre la almohadilla de ECG y la piel. Verifique el ECG y la señal respiratoria en el software de la computadora para asegurarse de que se vean los complejos QRS adecuados en el monitor. Para ello, marque Logic Lead en la pestaña Source Set Up (Configuración de fuente) y elija la derivación que ofrezca la curva de ECG más clara.NOTA: Los cables lógicos corresponden a las tres almohadillas de ECG que están conectadas a la derecha, la izquierda del pecho y la parte inferior de la pierna. Cada derivación representa una curva de ECG. Ajuste la ganancia para la altura de señal adecuada, generalmente 4 u 8 es bueno. Seleccione la doble compuerta. En la pestaña Configuración de pantalla, ajuste la configuración de la pantalla para obtener una vista clara de la señal: marque las casillas junto a ECG y RESP y establezca cada una en 500. En la pestaña Configuración del disparador, confirme que el canal A, el canal B y DualTrig estén marcados. Asegúrese de que también se establezcan los siguientes parámetros: Umbral: cuando la señal cae por debajo de este valor; Establezca el valor en 2.500; Histéresis: asegúrese de que la señal cruza la histéresis para crear un punto de activación de software en el que comienza un nuevo ciclo de activación; Establezca el valor en 300; Retraso: espere antes de que se envíe el disparador; Establezca el valor en 100; Inhibir: no se puede generar ninguna señal durante este período, establezca el valor en 200. Asegúrese de que el umbral para el ECG esté por debajo del valor de histéresis y por encima del pico del segmento sT en la pantalla de visualización. Avance el animal en el escáner y presione Actualizar imagen. Adquiera una imagen de exploración de rayos X del animal para seleccionar el campo de visión y la cobertura de escaneo anatómico apropiados para la imagen de microTC posterior. Realice la adquisición de imágenes de angiografía por microTC utilizando los siguientes parámetros: Aumentos: Ultra enfoque, Ángulo de escaneo: Escaneo completo (360), Energía: Simple, Modo de escaneo: Cerrado, Configuración: Predeterminada (rotación completa de 360°, configuración predeterminada del tubo de rayos X de 0,33 mA y 55 kV, 0,750° grados por paso, 1 proyección por paso, agrupamiento 1 x 1 y tiempo de exposición de 40 ms; la compuerta doble significa activación cardíaca y respiratoria) (Figura 11). Después de completar el escaneo, transfiera al animal a una jaula de recuperación precalentada. Una vez que el animal se haya recuperado por completo, transfiéralo de nuevo a su jaula principal. Reconstruya imágenes de microTC utilizando el software del sistema. Después de cargar la imagen, coloque las barras azules para que se extiendan a ambos lados del área anatómica de interés; Obtenga una vista previa de un sector para que el volumen sea lo más pequeño y lo más restringido posible al mouse (esta etapa ayuda a reducir el tamaño de la imagen reconstruida). Active el contorno del volumen de interés para optimizar el límite de la imagen. Elija un tamaño de vóxel de 40 μm, un filtro de proyección de Hann y un filtro de volumen gaussiano (80 μm). Ir a Avanzado | Activación basada en imágenes y ajuste las ventanas de activación y la fase a 0,5 y 0,6, respectivamente, elija 10 fases para la activación cardíaca y, a continuación, presione el botón de reconstrucción de volumen .