Trapianto ortotopico di fegato di successo nei topi che utilizzano l'angiografia con tomografia microcomputerizzata

I topi maschi C57BL/6J (30 g di peso corporeo) sono stati ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso il Nationwide Children’s Hospital Animal Facility. Tutte le procedure sono state eseguite in modo umano secondo la Guida del NIH e del Consiglio Nazionale delle Ricerche per la cura e l’uso umano degli animali da laboratorio e con l’approvazione del Comitato per la cura e l’uso degli animali istituzionali del Nationwide Children’s Hospital (Protocollo IACUC AR17-00045). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e le attrezzature utilizzati in questo protocollo. 1. Configurazione iniziale per l’intervento chirurgico di trapianto Installare dispositivi chirurgici.Installare dispositivi di monitoraggio chirurgico (ad es. dispositivo di monitoraggio della frequenza cardiaca, pulse-ox, sistema di monitoraggio modulare) e macchine per anestesia. Se disponibile, accendere la tavola riscaldante chirurgica a 42 °C. Assicurarsi che le macchine per la ventilazione e l’anestesia siano accese per riscaldare l’evaporatore di isoflurano. Riempire il serbatoio dell’anestesia con 30 ml di isoflurano liquido e assicurarsi che il ventilatore sia collegato all’ossigeno.NOTA: In questo protocollo, non intubiamo l’animale; Utilizzare solo un cono nasale per l’ossigenazione. Registrare il peso corporeo dei topi riceventi e donatori. Accendi il microscopio operatorio ad alta potenza e regola l’altezza e la messa a fuoco in base alle preferenze del chirurgo. Assicurarsi che i restanti dispositivi chirurgici siano accesi (ad es. dispositivo di elettrocauterizzazione). Preparare e disporre gli strumenti chirurgici, nonché le fascette chirurgiche di nylon 10-0 (Figura 2).NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave a 121 °C per 30 min. Inoltre, diverse configurazioni di strumenti chirurgici potrebbero essere ugualmente efficaci. Preparare i bracciali per gli stent della vena porta (PV) e del dotto biliare comune (CBD) (Figura 3). Posizionare l’angioettatere, così come il PE10, su una superficie sterile sotto il microscopio ad alta potenza. Utilizzando una lama chirurgica #11, tagliare l’angiocatetere per formare un bracciale lungo 1,5 mm con una linguetta di circa 0,75 mm nella parte superiore del corpo del bracciale; tagliare il tubo in polietilene (PE10) a una lunghezza di 2,5 mm. Conservare i bracciali e lo stent in soluzione fisiologica sterile fino al momento dell’uso.NOTA: Questo modello di trapianto utilizza un angiocatetere da 20 G per realizzare bracciali per la ricostruzione del PV, nonché un tubo in polietilene 10 (PE10) per la ricostruzione del CBD. Tutte le altre anastomosi sono cucite a mano. Prepara le soluzioni. Preparare un’iniezione di eparina che verrà somministrata a 100 U in 0,5 mL di soluzione di istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK). Conservare la soluzione salina, eparina-salina, PBS e HTK su ghiaccio. 2. Approvvigionamento di topi donatori Indurre l’anestesia nel topo donatore mettendolo in una camera di inalazione di isoflurano. Assicurarsi che la concentrazione di isoflurano sia di circa il 2,5% con un flusso di ossigeno di 2 ml/min. Attendere 5 minuti affinché si sviluppi un piano chirurgico di anestesia. Per garantire il corretto livello di anestesia, pizzicare il mouse per suscitare una reazione; Una mancanza di reazione indica che il livello corretto di anestesia è stato raggiunto. Radere l’addome del mouse utilizzando un tagliacapelli elettronico e posizionare il mouse in posizione supina sulla tavola riscaldante. Pulisci l’addome con iodio povidone, quindi etanolo al 70%. Metti un unguento oftalmico sotto gli occhi dei topi per prevenire la secchezza. Posizionare il topo sotto il microscopio ad alta potenza e mantenerlo sotto anestesia utilizzando un’inalazione di isoflurano di concentrazione del 2% con un flusso di ossigeno di 2 ml/min. Eseguire una laparotomia della linea mediana con un paio di forbici (preferenza del chirurgo) dal processo xifoideo alla sinfisi pubica. Successivamente, eseguire un’ulteriore incisione trasversale per creare un motivo “a croce” inferiore alle costole. Utilizzando una pinza emostatica per zanzare, ritrarre il processo xifoideo per ottenere un’adeguata esposizione del contenuto addominale.NOTA: Le pinze possono essere fissate a seconda delle preferenze del chirurgo. Eviscerare l’intestino e posizionarlo sul lato sinistro della cavità addominale in una spugna di garza bagnata. Mobilizzare il fegato rimuovendo tutti gli attacchi legamentosi. Esporre l’arteria epatica corretta (pHA). Scheletrare il vaso utilizzando una pinza curva e legarlo con sutura di nylon 10-0. Sezionare l’intera lunghezza del CBD usando una combinazione di dissezione affilata e smussata. Eseguire una ductotomia (abbastanza grande per lo stent CBD) il più vicino possibile al bordo superiore del pancreas per dare una lunghezza adeguata per l’uso futuro (~1 cm dal bordo inferiore del fegato). Inserire lo stent del dotto biliare nel CBD con una pinza fine e fissarlo con una sutura di nylon 10-0. Legare l’aspetto distale del CBD utilizzando una sutura di nylon 10-0 (Figura 4). Ritrarre il lobo epatico destro verso lo xifoide utilizzando una spugna di garza bagnata ed esporre l’IVC. Mobilizzare l’IVC infraepatico (IHIVC) lontano dal retroperitoneo e cauterizzare la vena surrenale destra utilizzando un dispositivo di cauterizzazione portatile (vedere Tabella dei materiali). Sezionare l’arteria e la vena renale destra e legare rispettivamente con nylon 7-0 e 10-0. Tagliare la vena e l’arteria renale destra e gli attacchi legamentosi rimanenti. Infine, rimuovere il rene destro.NOTA: Questo viene fatto per avere una migliore esposizione quando finalmente si taglia l’IHIVC. Iniettare 0,5 mL di HTK freddo con una soluzione di eparina 100 U attraverso il PV con un ago da 30 G. Attendere 1 minuto affinché l’eparina si distribuisca sistematicamente. Tagliare la vena porta appena sopra la vena splenica e la vena mesenterica superiore. Iniettare lentamente la soluzione fredda di conservazione HTK con eparina nell’IHIVC con un ago da 30 G per perfondere il fegato del donatore. Interrompere l’iniezione della soluzione una volta che il fluido proveniente dal FV è limpido. Al termine dell’iniezione, posizionare una micro pinza su IHIVC appena sopra la vena renale destra e tagliare appena inferiormente alla pinza. Una volta completato questo passaggio, spegnere il ventilatore e interrompere l’isoflurano poiché l’animale è appena stato soppresso. Tagliare il CBD distalmente allo stent precedentemente posizionato al punto 2.7. Inoltre, identificare il dotto cistico e legare il dotto con una sutura in nylon 10-0. Quindi, afferrare la cupola della cistifellea con un paio di pinze e sezionare liberamente dalla fossa della cistifellea usando una combinazione di dissezione acuta e smussata. Una volta che la cistifellea è adeguatamente mobilizzata, utilizzando un paio di forbici a molla, completare la colecistectomia tagliando il dotto cistico sopra la sutura precedentemente posizionata. Ritrarre il fegato inferiormente per esporre l’IVC sopraepatico (SHIVC). Tagliare lo SHIVC prestando particolare attenzione a dare una lunghezza adeguata per l’anastomosi nell’animale ricevente. Sezionare ulteriori attacchi legamentosi liberi al fegato e consegnare il fegato del donatore ex-vivo e posizionare l’organo in un contenitore con soluzione fisiologica fredda. 3. Preparazione dell’allotrapianto di fegato sul tavolo Metti il ghiaccio in un contenitore isolato e posiziona una capsula di Petri sul letto di ghiaccio. Riempire la capsula di Petri con soluzione fisiologica fredda. Posizionare l’allotrapianto di fegato nella capsula in modo che la superficie viscerale sia esposta. Posizionare il PV attraverso la cuffia precedentemente selezionata ed estromettere la vena in modo che la superficie endoteliale interna sia esposta. Fissare il bracciale con sutura in nylon 10-0. Assicurarsi che la sutura si trovi all’interno delle scanalature della cuffia per ottenere i migliori risultati (Figura 5). Regolare l’alloinnesto epatico per esporre lo SHIVC e posizionare due 8-0 suture di nylon a ore 3′ e 9, rispettivamente, per l’eventuale anastomosi nell’animale ricevente. Regolare di nuovo l’alloinnesto epatico per esporre l’IHIVC e posizionare due 8-0 suture di nylon a ore 3′ e 9, rispettivamente, per l’eventuale anastomosi nell’animale ricevente. 4. Funzionamento del destinatario NOTA: Poiché si tratta di un’operazione sterile, utilizzare guanti e dispositivi di protezione individuale adeguati e somministrare antibiotici. Somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea come analgesia preoperatoria al momento dell’intervento. Esporre il pHA come nell’operazione del donatore; Utilizzare solo una laparotomia della linea mediana invece dell’incisione addominale precedentemente descritta. Mobilizzare il fegato e tagliare tutti gli attacchi legamentosi. Inoltre, legare i vasi frenici e paraesofagei sinistri con sutura in nylon 10-0. Ritrarre il fegato inferiormente e sezionare lo SHIVC dal retroperitoneo. Successivamente, ritrarre il fegato superiormente e sezionare l’IHIVC dal retroperitoneo. Cauterizzare le piccole vene a ponte e le vene lombari secondo necessità utilizzando la stessa tecnica descritta in precedenza. Cauterizzare la vena surrenale destra con il cauterismo manuale ed esporre l’ilo epatico. Legare il pHA con una sutura in nylon 10-0. Successivamente, sezionare il CBD libero dal PV e legare il CBD con una sutura 7-0 vicino alla biforcazione del CBD per dare una lunghezza adeguata per l’anastomosi del CBD. Utilizzare un micro clamp per bloccare l’IVC infraepatico e legare temporaneamente il PV con una sutura 7-0. Iniziare la fase an-epatica. Interrompere l’inalazione di isoflurano.NOTA: Dopo aver clampato la vena porta e l’IVC, il ritorno venoso epatico è completamente bloccato nella fase anepatica. L’anestetico isoflurano inalato viene metabolizzato dal fegato; Pertanto la sua inalazione viene momentaneamente interrotta poiché l’accumulo può portare al collasso cardiopolmonare. Attraverso il PV del fegato nativo, iniettare 0,5 ml di eparina-soluzione salina con un ago da 30 G per lavare l’organo. Posizionare i morsetti microvascolari sullo SHIVC e sull’IHIVC il più prossimalmente e distalmente possibile per lasciare una lunghezza adeguata per l’anastomosi. Tagliare lo SHIVC, IHIVC, PV nativo (vicino alla sutura precedentemente posizionata) e qualsiasi attacco legamentoso rimanente al fegato nativo del ricevente e consegnare il fegato nativo ex vivo.NOTA: Il morsetto IHIVC deve trovarsi sopra la vena renale destra. Posizionare l’allotrapianto di fegato del donatore all’interno della cavità addominale e ritrarre l’ilo dell’allotrapianto del donatore per esporre il PV. Sciacquare sia il PV donatore che quello nativo con 0,5 mL di soluzione salina di eparina utilizzando un ago da 30 G per disarieggiare i vasi ed evitare l’embolia gassosa. Quindi, inserire la cuffia precedentemente realizzata del PV del donatore nel lume del PV del fegato ricevente e, se necessario, posizionare i punti di sutura per aiutare con l’anastomosi (sutura 8-0). Fissare l’anastomosi con la sutura 7-0 (Figura 6). Ruotare la tavola di 180°. Eseguire un’anastomosi cucita a mano con sutura in nylon 10-0 con il donatore e SHIVC nativo. Dopo aver completato l’anastomosi della parete posteriore, sciacquare con 0,5 mL di soluzione fisiologica di eparina per eliminare l’aria ed evitare l’embolia gassosa. Anastomosi completa della parete superiore (Figura 7). Rimuovere prima la sutura di legatura del PV; quindi, rimuovere le pinze vascolari da SHIVC per iniziare la riperfusione. Terminare la fase an-epatica e riprendere l’inalazione di isoflurano. Eseguire l’anastomosi a mano con sutura in nylon 10-0, allo stesso modo dell’anastomosi SHIVC, per ricostruire l’IHIVC. Dopo aver completato la ricostruzione, rimuovere il micromorsetto dall’IHIVC nativo e donatore per eseguire la riperfusione (Figura 8). Eseguire l’anastomosi del CBD creando una ductotomia sul CBD ricevente vicino alla sutura precedentemente posizionata. Inserire lo stent nel CBD del donatore nel lume CBD del ricevente e fissare l’anastomosi con la sutura 10-0 (Figura 9). Irrigare la cavità addominale con 1 mL di soluzione fisiologica; Controllare l’emostasi e cauterizzare eventuali vasi sanguinanti rimanenti. Chiudere l’incisione addominale in due strati utilizzando la sutura 6-0. Mettere l’animale in un’incubatrice calda (42 °C) per il recupero e non lasciare l’animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza e un’attività sufficiente. Somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea dopo l’intervento chirurgico e continuare la somministrazione ogni 8-12 ore per 48 ore dopo l’intervento. Inoltre, somministrare carprofene (0,2 ml disciolti in 400 ml di acqua) attraverso la bottiglia d’acqua dell’animale ricevente per un massimo di 7 giorni dopo l’intervento chirurgico. Osservare l’animale ricevente per 4-5 ore e, una volta che si è completamente ripreso, riportarlo nel luogo di stabulazione poiché ora è sicuro stare con altri animali.NOTA: I farmaci antidolorifici e gli antibiotici possono essere somministrati secondo le raccomandazioni del comitato etico locale per gli animali. 5. Imaging angiografico microCT di topo Dopo aver osservato il topo per l’intervallo di studio predeterminato, preparare il topo a valutare la pervietà dell’allotrapianto utilizzando l’angiografia microCT. Assicurarsi che le macchine per la ventilazione e l’anestesia siano accese per riscaldare l’evaporatore di isoflurano. Riempire il serbatoio dell’anestesia con 30 ml di isoflurano liquido e assicurarsi che il ventilatore sia collegato all’ossigeno. Accendere lo scanner microCT e assicurarsi che tutto il software funzioni correttamente. Avviare il software di acquisizione sul sistema di scansione microCT. Sul monitor dell’unità microCT, fare clic su Inizializza sistema e scegliere la modalità di scansione TC. Espellere il letto; Fissare il piano del mouse e bloccarlo. Accendere il piano riscaldante a 42 °C per la gabbia di recupero. Riempire una siringa da 1 mL con 100 μL di mezzo di contrasto CT. Collegare un ago calibro 30 per la futura somministrazione endovenosa di mezzo di contrasto. Assicurarsi che non vi siano bolle d’aria nella siringa. Posiziona un topo nel sistema di ritenuta della vena caudale. Una volta che il mouse è completamente all’interno del sistema di ritenuta, chiudere il cancello del sistema, lasciare che la coda cada verticalmente e pulirla accuratamente con una soluzione alcolica (etanolo al 70%).NOTA: Il successo nell’incannulamento della vena caudale può essere aumentato riscaldando la coda dell’animale tenendola in una mano guantata per diversi minuti. Afferrare la coda verso l’aspetto distale e posizionare due dita (indice e medio) attorno alla coda prossimale al sito di iniezione pianificato. Posizionare l’aspetto distale della coda (sotto il sito di iniezione) tra il pollice e l’anulare. Con entrambe le dita, esercitare una leggera pressione e inserire l’ago nella vena a una profondità ridotta, assicurandosi che la siringa e l’ago siano paralleli alla coda. Mentre si rilascia la pressione del dito indice sulla coda prossimale, somministrare per via endovenosa il mezzo di contrasto TC. Evitare l’aspirazione con la siringa in quanto ciò può causare il collasso della vena.NOTA: Non deve essere avvertita alcuna resistenza durante l’iniezione se l’ago è posizionato in modo appropriato nella vena. In caso di resistenza, rimuovere l’ago e reinserirlo al di sopra del sito di iniezione originale. Se l’incannulamento della vena fallisce anche dopo due tentativi, sostituire l’ago. Dopo aver iniettato con successo il mezzo di contrasto e aver rimosso l’ago, applicare una leggera compressione sul sito di iniezione utilizzando una garza sterile per fermare l’emorragia. Trasferire il topo nella camera di inalazione dell’isoflurano e impostare la concentrazione al 2,5% con un flusso di ossigeno di 2 ml/min e attendere 3-4 minuti. Una volta stabilito un piano di anestesia, trasferire rapidamente il mouse sul letto dello scanner microCT e posizionarlo in posizione prona sul tavolo dello scanner (Figura 10). Copri gli occhi dell’animale con la giusta quantità di unguento oftalmico. Posiziona l’ogiva nasale in modo appropriato sull’animale e assicurati che l’aria e l’isoflurano scorrano correttamente attraverso l’ogiva. Utilizzare gli stessi parametri di anestesia descritti in precedenza (passaggio 5.12). Lubrificare e inserire una sonda di temperatura rettale per monitorare continuamente la temperatura corporea dell’animale durante l’imaging. Posizionare un respiratore a contatto con il mouse. Utilizzare il nastro adesivo per fissare un elettrocardiogramma agli arti posteriori sinistro, destro e sinistro. Utilizzare il gel per ultrasuoni per migliorare il segnale tra il pad ECG e la pelle. Controllare l’ECG e il segnale respiratorio sul software del computer per assicurarsi che i complessi QRS corretti siano visibili sul monitor. A tale scopo, selezionare Derivazione logica nella scheda Impostazione origine e scegliere la derivazione che offre la curva ECG più chiara.NOTA: Le derivazioni logiche corrispondono ai tre elettrodi ECG collegati alla parte destra e sinistra del torace e alla parte inferiore della gamba. Ogni derivazione rappresenta una curva ECG. Impostare il guadagno per un’altezza del segnale corretta, di solito 4 o 8 è buono. Selezionare il doppio gating. Nella scheda Display Set Up, regolare le impostazioni del display per una visualizzazione chiara del segnale: selezionare le caselle accanto a ECG e RESP e impostare ciascuno su 500. Nella scheda Trigger Set Up, verificare che il canale A, il canale B e DualTrig siano selezionati. Assicurarsi che siano impostati anche i seguenti parametri: Soglia: quando il segnale scende al di sotto di questo valore; impostare il valore su 2.500; Isteresi: assicurarsi che il segnale attraversi l’isteresi per creare un punto di innesco software in corrispondenza del quale inizia un nuovo ciclo di attivazione; impostare il valore su 300; Ritardo: attendere prima che il trigger venga inviato; impostare il valore su 100; Inibizione: durante questo periodo non è possibile generare alcun segnale, impostare il valore a 200. Assicurarsi che la soglia per l’ECG sia inferiore al valore di isteresi e al di sopra del picco del segmento sT sullo schermo del display. Far avanzare l’animale nello scanner e premere Aggiorna immagine. Acquisire un’immagine da ricognizione radiografica dell’animale per selezionare il campo visivo appropriato e la copertura della scansione anatomica per la successiva immagine microCT. Eseguire l’acquisizione di immagini per angiografia microCT utilizzando i seguenti parametri: Ingrandimenti: Ultra focus, Angolo di scansione: Scansione completa (360), Energia: Singola, Modalità di scansione: Gated, Impostazione: Predefinita (rotazione completa di 360°, impostazioni predefinite del tubo a raggi X di 0,33 mA e 55 kV, 0,750° gradi per passo, 1 proiezione per passo, binning 1 x 1 e tempo di esposizione di 40 ms; il doppio gating indica gating cardiaco e respiratorio) (Figura 11). Al termine della scansione, trasferire l’animale in una gabbia di recupero preriscaldata. Una volta che l’animale si è completamente ripreso, trasferiscilo di nuovo nella sua gabbia primaria. Ricostruisci le immagini microCT utilizzando il software di sistema. Dopo aver caricato l’immagine, impostare le barre blu in modo che si trovi a cavallo dell’area anatomica di interesse; Visualizzare l’anteprima di una sezione per ridurre il volume e vincolare il più possibile il mouse (questa fase consente di ridurre le dimensioni dell’immagine ricostruita). Attivare il contorno del volume di interesse per ottimizzare il contorno dell’immagine. Scegli la dimensione del voxel di 40 μm, il filtro di proiezione Hann e il filtro del volume gaussiano (80 μm). Vai a Avanzate | Gating basato su immagini e regolare le finestre di attivazione e la fase rispettivamente su 0,5 e 0,6, scegliere 10 fasi per il gating cardiaco, quindi premere il pulsante di ricostruzione del volume .