زرع الكبد التقويمي الناجح في الفئران باستخدام تصوير الأوعية المقطعي المحوسب
Summary
في هذا البروتوكول ، نناقش تنفيذ نموذج لزراعة الكبد التقويمية الناجحة (OLT) في الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة المواد المساعدة لمزيد من تحليل سالكية الطعم الخيفي بعد نجاح OLT في الماوس ، وتحديدا باستخدام فحوصات التصوير المقطعي المحوسب (microCT).
Abstract
تصوير الأوعية بالتصوير المقطعي المجهري (microCT) هو مورد لا يقدر بثمن للباحثين. سمحت التطورات الجديدة في هذه التكنولوجيا بالحصول على صور عالية الجودة للأوعية الدموية الدقيقة وهي أدوات عالية الدقة في مجال زراعة الأعضاء. في هذا النموذج من زراعة الكبد التقويمية (OLT) في الفئران ، يتيح microCT الفرصة لتقييم مفاغرة الطعم الخيفي في الوقت الفعلي وله فائدة إضافية تتمثل في عدم الاضطرار إلى التضحية بالحيوانات الدراسية. يؤدي اختيار التباين ، بالإضافة إلى إعدادات الحصول على الصور ، إلى إنشاء صورة عالية الدقة ، مما يمنح الباحثين معلومات لا تقدر بثمن. وهذا يسمح بتقييم الجوانب التقنية للإجراء بالإضافة إلى تقييم العلاجات المختلفة على مدى فترة زمنية طويلة. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل نموذج OLT في الفئران بطريقة تدريجية وأخيرا نصف بروتوكول microCT الذي يمكن أن يعطي صورا عالية الجودة ، مما يساعد الباحثين في التحليل المتعمق لزراعة الأعضاء الصلبة. نحن نقدم دليلا خطوة بخطوة لزراعة الكبد في الماوس ، بالإضافة إلى مناقشة موجزة لبروتوكول لتقييم سالكية الكسب غير المشروع من خلال تصوير الأوعية بالأشعة المقطعية الدقيقة.
Introduction
الزرع هو العلاج الفعال الوحيد لمرض الكبد في المرحلة النهائية. لا يمكن إنكار أن فائدة زراعة الكبد ممتازة ، حيث يبلغ متوسط البقاء على قيد الحياة 11.6 سنة مقابل 3.1 سنة في قائمة الانتظار1. ومع ذلك ، هناك قيود كبيرة تحد من التطبيق الواسع لزراعة الكبد ، وتشمل الأهم من ذلك ، نقص الأعضاء المانحة المناسبة وعالية الجودة. وبالتالي ، سيتطلب توسيع مجموعة الأعضاء المانحة استراتيجيات مبتكرة تسمح باستخدام الطعم الخيفي الذي يعتبر حاليا غير مناسب اليوم ، مما يزيد من هامش الأمان للزرع. لذلك ، لتحسين الوصول إلى زراعة الكبد ، لا بد من إجراء دراسات قبل السريرية في الصغيرة.
أهمية خاصة لأبحاث زرع الأعضاء هي في الجسم الحي نماذج من زرع. زرع الكبد التقويمي للفأر (OLT) موجود منذ ما يقرب من 30 عاما2 وهو أمر حيوي لدراسة العديد من جوانب الزرع ، بما في ذلك توصيف الاستجابات المناعية ، وإصابة نقص التروية ، والرفض الحاد ، والآثار العلاجية للعوامل الجديدة ، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل3،4،5،6،7. يعد استخدام الفئران لدراسة الزرع أمرا حيويا لأنه يسمح باستخدام خطوط الفئران المعدلة وراثيا لدراسة تأثير مسارات جزيئية محددة على نتائج الزرع. تم وصف البروتوكولات المعمول بها لزراعة كبد الفأر بشكل جيد سابقا 8,9.
توجد طرق متعددة للمفاغرة للوريد الأجوف السفلي فوق وتحت الكبد (IVC) والوريد البابي (PV) والقناة الصفراوية المشتركة (CBD). يعتمدون عادة على مفاغرة اليد أو تقنية الكفة الوعائية المعدلة المشابهة لزراعة رئة الفئران10،11،12. خطوة مهمة في الدراسة طويلة الأجل وبقاء الفئران المتلقية ، بالإضافة إلى تطوير برنامج مستدام لزراعة كبد الفأر ، هي القدرة على تقييم هذه المفاغرة الحرجة. غالبا ما تعتمد طرق التصوير لتقييم سالكية الطعم الخيفي للكبد على الموجات فوق الصوتية والتصوير المقطعي المحوسب (CT) في الإعداد السريري13,14. يتمتع التصوير المقطعي المحوسب بميزة واضحة على الموجات فوق الصوتية حيث يمكن أن يوفر مناظر للبطن بالكامل لتشمل كل مفاغرة ، على الرغم من أن الحصول على هذه المشاهدات بالموجات فوق الصوتية قد يكون صعبا بشكل خاص في الصغيرة. تم تخصيص أبحاث وموارد كبيرة لتطوير التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لغرض تعزيز الدراسات على والمعلومات التي يمكننا جمعها من هذه النماذج للإصابة والمرض15،16. نصف هنا بروتوكولا لزراعة كبد الفأر التقويمي (الشكل 1) ونصف بإيجاز بروتوكولا للتصوير المقطعي المحوسب لتقييم سالكية الطعم الخيفي ومتانة المفاغرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم وصف OLT في القوارض بشكل جيد في الأدبيات2،8. لإجراء هذا الإجراء الذي يتطلب الكثير من الناحية الفنية ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى عدة سنوات من الجراحة المجهرية (أو الجراحة بشكل عام) لأن هذا ينطوي على فهم قوي للتشريح والقدرة التقنية. في تطوير هذا النموذج ، واجهنا العديد من المشكلات الفنية التي تدور جميعها حول المفاغرة. خاصة مع مفاغرة PV ، غالبا ما يكون من الصعب تثبيت الوريد لمفاغرة. لقد وجدنا أن وضع واحد أو اثنين من الغرز (تفضيل الجراح) يساعد في تسهيل وضع الكفة. وتجدر الإشارة إلى أن وضع المزيد من الغرز يزيد من وقت الجراحة.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن SHIVC عميق داخل تجويف البطن ويصعب وضع مشبك عليه لإعطاء التعرض الكافي. لقد وجدنا أنه إذا كان الماوس مسترخيا قدر الإمكان في ضبط النفس ، فإن ذلك سيضيف إلى مرونة الوريد. في النهاية ، سيكون الأمر متروكا للجراح لتحديد الموضع المناسب مع الممارسة. علاوة على ذلك ، مع مفاغرة CBD ، تكون القناة مرة أخرى حساسة للغاية. قد يكون من الصعب وضع خيوط البقاء لتثبيت القناة ، وربما يساعد وضعها على قطعة صغيرة من الشاش في تثبيتها. أخيرا ، نظرا لأن جميع الثدييات الصغيرة حساسة بشكل فريد فيما يتعلق بوقت التخدير ، فمن المهم إجراء الجراحة في أسرع وقت ممكن. الأوقات الجراحية المثالية هي كما يلي: 1) عملية مانحة ، 45-60 دقيقة. 2) إعداد الجدول الخلفي ، 15 دقيقة ؛ 3) عملية المستلم ، 60-80 دقيقة. الممارسة سوف تساعد في تقليل الحركة الضائعة.
مع تقدم النماذج الحيوانية ، تقدمت أيضا القدرة على تقييم نجاح التدخلات الدراسية. تم استخدام MicroCT لأول مرة لإجراء دراسات حول الأوعية الدموية في الفئران في أواخر تسعينيات القرن العشرين17. هناك العديد من التحديات لإجراء دراسات تصوير الأوعية المجهرية الدقيقة والواضحة في القوارض. ومع ذلك ، فإن معظم التحديات تنشأ من دورات القلب والجهاز التنفسي القصيرة لهذه الثدييات. يتم التغلب على ذلك باستخدام التعرضات القصيرة للحد من آثار الحركة بالإضافة إلى ارتفاع معدلات طلاقة الفوتون18. بشكل عام ، وجدنا أن استخدام بوابات القلب ، وكذلك تعديل تركيزات الأيزوفلوران لتقليل معدل التنفس ، أنتج أوضح الصور. لقد وجدنا أيضا أن استخدام توقيت التباين الخاص بالقوارض لمراحل محددة: المرحلة الشريانية الكبدية ، والمرحلة البابية الوريدية ، والمرحلة المتأخرة قد حسنت أيضا التصور19. يتميز استخدام تباين ExiTron nano 12000 بالعديد من المزايا ويمكن أن يحسن جودة الصورة الإجمالية. يوفر أقوى تعزيز للتباين في الكبد20 والدم21. ميزة أخرى هي أن التباين موجود في الكبد لمدة تصل إلى 120 ساعة بعد الحقن الأولي ، مما قد يقلل من سمية الكبد المرتبطة به حيث يلزم تقليل التباين إذا كانت هناك حاجة إلى فحوصات متكررة20.
علاوة على ذلك ، نظرا لإجراء عمليات المسح باستخدام الفأر المخدر بالإيزوفلوران ، لا يتغير تحسين التباين مع هذا التغيير في علم وظائف الأعضاء20. من خلال استخدام تقنيات التصوير هذه وتباين ExiTron ، يمكن إجراء تقييم واضح للمفاغرة الناجحة في OLT. يسمح التصوير المقطعي المحوسب بالتقييم غير الجراحي للطعم الخيفي في الجسم الحي على مدى فترة طويلة. يقلل هذا البروتوكول من عدد التي يجب التضحية بها لتقييم مفاغرة الأوعية الدموية وإتاحة الفرصة لدراسة العلاجات على مدى عدة أسابيع وتأثيرها على الأوعية الدموية.
القيود
تجدر الإشارة إلى أنه في حين حدثت مراجعات متعددة لنموذج OLT لإتقان تقنيته ، فإن تصور المفاغرة باستخدام microCT لا يزال عملية مستمرة. علاوة على ذلك ، يقدم الماوس OLT نظرة ثاقبة فريدة في طب الزرع. ومع ذلك ، فهو ليس نموذجا شاملا لأنه من الصعب إبقاء هذه الفئران على قيد الحياة بعد أسبوع 1. يجب استخدام نماذج زرع إضافية أيضا لإثبات التجارب قبل السريرية.
الاستنتاجات
تقدم التقدم في التصوير المقطعي المحوسب بسرعة خلال العقد الماضي ، مما وفر للباحثين أدوات جديدة لا تقدر بثمن في مجال النماذج الحيوانية وزرعها. في المستقبل ، سيقدم التصوير 3D الأكثر تفصيلا مزيدا من الأفكار حول البحث والاكتشاف.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم SMB من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) منحة R01DK1234750. يتم دعم BAW من خلال منحة المعهد الوطني للقلب والرئة والدم من المعاهد الوطنية للصحة R01HL143000.
Materials
| #11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| 10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
| 20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
| 30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
| Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
| Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
| Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
| NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
| PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
| perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
| Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
| Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |
References
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465 (2021).
- Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
- Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006 (2022).
- Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584 (2022).
- Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628 (2020).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445 (2021).
- Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025 (2016).
- Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
- Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
- Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
- Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
- Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
- Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174 (2013).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
