Transplantation hépatique orthotopique réussie chez la souris à l’aide de l’angiographie par microtomodensitométrie

Des souris mâles C57BL/6J (30 g de poids corporel) ont été hébergées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à l’animalerie du Nationwide Children’s Hospital. Toutes les procédures ont été effectuées sans cruauté conformément au Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals du National Research Council et du National Research Council et avec l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Hôpital national pour enfants (protocole IACUC AR17-00045). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et équipements utilisés dans ce protocole. 1. Configuration initiale pour la chirurgie de transplantation Mettre en place des dispositifs chirurgicaux.Mettre en place des dispositifs de surveillance chirurgicale (c.-à-d. un dispositif de surveillance de la fréquence cardiaque, un oxymètre de pouls, un système de surveillance modulaire) et des appareils d’anesthésie. Si possible, allumez la planche chauffante chirurgicale à 42 °C. Assurez-vous que les appareils de ventilation et d’anesthésie sont allumés pour réchauffer l’évaporateur d’isoflurane. Remplissez le réservoir d’anesthésie avec 30 mL d’isoflurane liquide et assurez-vous que le ventilateur est connecté à l’oxygène.REMARQUE : Dans ce protocole, nous n’intubons pas l’animal ; N’utilisez qu’un cône nasal pour l’oxygénation. Enregistrez le poids corporel des souris receveuses et donneuses. Allumez le microscope chirurgical haute puissance et ajustez la hauteur et la mise au point selon les préférences du chirurgien. Assurez-vous que les autres dispositifs chirurgicaux sont allumés (c.-à-d. appareil d’électrocautérisation). Préparez et disposez les instruments chirurgicaux, ainsi que les attaches chirurgicales en nylon 10-0 (figure 2).REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux ont été autoclavés à 121 °C pendant 30 minutes. De plus, différentes configurations d’instruments chirurgicaux pourraient être tout aussi efficaces. Préparez les brassards pour les endoprothèses de la veine porte (PV) et des voies cholédoques (CBD) (Figure 3). Placez l’angiocathéter, ainsi que le PE10, sur une surface stérile sous le microscope haute puissance. À l’aide d’une lame chirurgicale #11, coupez l’angiocathéter pour former un brassard de 1,5 mm de long avec une languette d’environ 0,75 mm en haut du corps du brassard ; Coupez le tube en polyéthylène (PE10) à une longueur de 2,5 mm. Conservez les brassards et l’endoprothèse dans une solution saline stérile jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être utilisés.REMARQUE : Ce modèle de transplantation utilise un angiocathéter de 20 G pour fabriquer des brassards pour la reconstruction PV, ainsi qu’un tube en polyéthylène 10 (PE10) pour la reconstruction du CBD. Toutes les autres anastomoses sont cousues à la main. Préparez des solutions. Préparez une injection d’héparine qui sera administrée à 100 U dans 0,5 mL de solution d’histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK). Conservez la solution saline, l’héparine-solution saline, le PBS et la solution de conservation HTK sur de la glace. 2. Approvisionnement en souris donneuses Induire l’anesthésie chez la souris donneuse en la plaçant dans une chambre d’inhalation d’isoflurane. Assurez-vous que la concentration d’isoflurane est d’environ 2,5 % avec un débit d’oxygène de 2 mL/min. Attendez 5 min pour qu’un plan chirurgical d’anesthésie se développe. Pour assurer le bon niveau d’anesthésie, pincez l’orteil de la souris pour provoquer une réaction ; Une absence de réaction indique que le niveau d’anesthésie approprié a été atteint. Rasez l’abdomen de la souris à l’aide d’une tondeuse électronique et placez la souris en position couchée sur le dos sur la planche chauffante. Nettoyez l’abdomen avec de la povidone iodée, puis de l’éthanol à 70 %. Placez une pommade ophtalmique sous les yeux des souris pour éviter la sécheresse. Placez la souris sous le microscope à haute puissance et maintenez-la sous anesthésie à l’aide d’une inhalation d’isoflurane à une concentration de 2 % avec un débit d’oxygène de 2 mL/min. Effectuer une laparotomie médiane avec une paire de ciseaux (préférence du chirurgien) du processus xiphoïde à la symphyse pubienne. Ensuite, effectuez une incision transversale supplémentaire pour créer un motif en forme de croix inférieur aux côtes. À l’aide d’une pince hémostatique anti-moustique, rétractez le processus xiphoïde pour obtenir une exposition adéquate du contenu abdominal.REMARQUE : Les pinces peuvent être fixées selon les préférences du chirurgien. Éviscérez les intestins et placez-les sur le côté gauche de la cavité abdominale dans une éponge de gaze humide. Mobiliser le foie en enlevant toutes les attaches ligamentaires. Exposer l’artère hépatique appropriée (pHA). Squelettiser le vaisseau à l’aide d’une pince courbe et le ligaturer avec une suture en nylon 10-0. Disséquez toute la longueur du CBD à l’aide d’une combinaison de dissection tranchante et émoussée. Effectuez une ductotomie (assez grande pour le stent CBD) le plus près possible du bord supérieur du pancréas pour donner une longueur adéquate pour une utilisation future (~1 cm du bord inférieur du foie). Insérez l’endoprothèse des voies biliaires dans le CBD à l’aide d’une pince fine et fixez-la avec une suture en nylon 10-0. Liquez l’aspect distal du CBD à l’aide d’une suture en nylon 10-0 (Figure 4). Rétractez le lobe hépatique droit vers le xiphoïde à l’aide d’une éponge de gaze humide et exposez l’IVC. Mobiliser la CIV infra-hépatique (IHIVC) à l’écart du rétropéritoine et cautériser la veine surrénale droite à l’aide d’un appareil de cautérisation portatif (voir le tableau des matériaux). Disséquez l’artère rénale et la veine droites et ligaturez avec du nylon 7-0 et 10-0, respectivement. Coupez la veine rénale et l’artère droites et les attaches ligamentaires restantes. Enfin, retirez le rein droit.REMARQUE : Ceci est fait pour avoir une meilleure exposition lors de la coupe finale de l’IHIVC. Injecter les 0,5 mL de HTK froid avec une solution d’héparine à 100 U à travers le PV à l’aide d’une aiguille de 30 G. Attendez 1 min que l’héparine se distribue systématiquement. Coupez la veine porte juste au-dessus de la veine splénique et de la veine mésentérique supérieure. Injecter lentement une solution froide de conservation HTK avec de l’héparine dans l’IHIVC avec une aiguille de 30 G pour perfuser le foie du donneur. Arrêtez d’injecter la solution une fois que le fluide provenant du PV est clair. Une fois l’injection terminée, placez une micro-pince sur l’IHIVC juste au-dessus de la veine rénale droite et coupez juste en dessous de la pince. Une fois cette étape terminée, éteignez le ventilateur et arrêtez l’isoflurane car l’animal vient d’être euthanasié. Coupez le CBD distalement sur le stent qui a été précédemment placé à l’étape 2.7. De plus, identifiez le canal cystique et ligaturez-le avec une suture en nylon 10-0. Ensuite, saisissez le dôme de la vésicule biliaire avec une paire de pinces et disséquez en vous libérant de la fosse de la vésicule biliaire en utilisant une combinaison de dissection tranchante et émoussée. Une fois que la vésicule biliaire est suffisamment mobilisée, à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort, complétez la cholécystectomie en coupant le canal cystique au-dessus de la suture précédemment placée. Rétractez le foie vers le bas pour exposer la CIV supra-hépatique (SHIVC). Couper le SHIVC en accordant une attention particulière pour donner une longueur adéquate à l’anastomose chez l’animal receveur. Disséquer les attaches ligamentaires supplémentaires libres au foie et livrer le foie du donneur ex-vivo et placer l’organe dans un récipient avec une solution saline froide. 3. Préparation de l’allogreffe hépatique sur la table arrière Placez de la glace dans un récipient isotherme et placez une boîte de Pétri sur le lit de glace. Remplissez la boîte de Pétri de sérum physiologique froid. Placez l’allogreffe hépatique dans la boîte de manière à ce que la surface viscérale soit exposée. Placez le PV à travers le brassard précédemment sélectionné et inversez la veine de manière à ce que la surface endothéliale interne soit exposée. Fixez le brassard avec une suture en nylon 10-0. Assurez-vous que la suture se trouve dans les rainures du brassard pour obtenir les meilleurs résultats (Figure 5). Ajustez l’allogreffe hépatique pour exposer le SHIVC et placez deux 8-0 sutures en nylon à 3′ et 9 heures, respectivement, pour une éventuelle anastomose chez l’animal receveur. Ajustez à nouveau l’allogreffe hépatique pour exposer l’IHIVC et placez deux 8-0 sutures en nylon à 3′ et 9 heures, respectivement, pour une éventuelle anastomose chez l’animal receveur. 4. Fonctionnement du destinataire REMARQUE : Comme il s’agit d’une opération stérile, utilisez des gants et un équipement de protection individuelle approprié et administrez des antibiotiques. Administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée comme analgésie préopératoire au moment de la chirurgie. Exposer le pHA comme dans l’opération donneuse ; N’utilisez qu’une laparotomie médiane au lieu de l’incision abdominale décrite précédemment. Mobiliser le foie et couper toutes les attaches ligamentaires. De plus, ligaturez les vaisseaux phréniques et parao-œsophagiens gauches avec une suture en nylon 10-0. Rétractez le foie vers le bas et disséquez le SHIVC du rétropéritoine. Ensuite, rétractez le foie par le haut et disséquez l’IHIVC du rétropéritoine. Cautériser les petites veines ponteuses et les veines lombaires si nécessaire en utilisant la même technique que celle décrite précédemment. Cautériser la veine surrénale droite à l’aide d’un cautéris manuel et exposer le hile hépatique. Mettez le pHA en contact avec une suture en nylon 10-0. Ensuite, disséquez le CBD sans PV et ligaturez le CBD avec une suture 7-0 près de la bifurcation du CBD pour donner une longueur adéquate pour l’anastomose du CBD. Utilisez une micro-pince pour clamper la CVI infra-hépatique et ligaturer temporairement le PV avec une suture 7-0. Commencez la phase an-hépatique. Arrêtez l’inhalation d’isoflurane.REMARQUE : Après le clampage de la veine porte et de la veine IVC, le retour veineux hépatique est complètement bloqué au stade anhépatique. L’isoflurane anesthésique inhalé est métabolisé par le foie ; Ainsi, son inhalation est momentanément arrêtée car l’accumulation peut entraîner un collapsus cardio-pulmonaire. À travers le PV du foie natif, injecter 0,5 mL d’héparine-solution saline avec une aiguille de 30 G pour rincer l’organe. Placer des pinces microvasculaires sur le SHIVC et l’IHIVC aussi proximalement et distalement que possible pour laisser une longueur adéquate pour l’anastomose. Coupez le SHIVC, IHIVC, PV natif (près de la suture précédemment placée) et toutes les attaches ligamentaires restantes au foie natif du receveur et délivrez le foie natif ex vivo.REMARQUE : La pince IHIVC doit être au-dessus de la veine rénale droite. Placez l’allogreffe hépatique du donneur à l’intérieur de la cavité abdominale et rétractez le hile de l’allogreffe du donneur pour exposer le PV. Rincer à la fois le donneur et le PV natif avec 0,5 mL de solution saline d’héparine à l’aide d’une aiguille de 30 G pour désaérer les vaisseaux afin d’éviter l’embolie gazeuse. Ensuite, insérez le brassard de PV du donneur précédemment fabriqué dans la lumière de la PV hépatique receveuse et, si nécessaire, placez des sutures de maintien pour aider à l’anastomose (suture 8-0). Fixez l’anastomose avec une suture 7-0 (Figure 6). Faites pivoter la planche de 180°. Effectuer une anastomose cousue à la main avec une suture en nylon 10-0 avec le donneur et le SHIVC natif. Après avoir terminé l’anastomose de la paroi postérieure, rincer avec 0,5 mL de solution saline à base d’héparine pour désaérer et éviter l’embolie gazeuse. Anastomose complète de la paroi supérieure (Figure 7). Retirez d’abord la suture de ligature de PV ; ensuite, retirez les pinces vasculaires de SHIVC pour commencer la reperfusion. Mettez fin à la phase an-hépatique et reprenez l’inhalation d’isoflurane. Effectuer une anastomose cousue à la main avec une suture en nylon 10-0, de la même manière que pour l’anastomose SHIVC, pour reconstruire l’IHIVC. Une fois la reconstruction terminée, retirez la micro-pince de l’IHIVC natif et du donneur pour la reperfuser (Figure 8). Effectuez l’anastomose du CBD en créant une ductotomie sur le CBD receveur près de la suture précédemment placée. Insérez l’endoprothèse dans le CBD donneur dans la lumière du CBD receveur et fixez l’anastomose avec une suture 10-0 (Figure 9). Irriguer la cavité abdominale avec 1 mL de solution saline ; Vérifier l’hémostase et cautériser les vaisseaux qui saignent restants. Fermez l’incision abdominale en deux couches en utilisant la suture 6-0. Placez l’animal dans un incubateur chaud (42 °C) pour qu’il se rétablisse et ne le laissez pas sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris conscience et qu’il ait retrouvé une activité suffisante. Administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée après la chirurgie et poursuivre l’administration toutes les 8 à 12 heures pendant 48 heures après la chirurgie. De plus, administrez du carprofène (0,2 ml dissous dans 400 ml d’eau) dans la bouteille d’eau de l’animal receveur jusqu’à 7 jours après la chirurgie. Observez l’animal receveur pendant 4 à 5 h, et une fois qu’il s’est complètement rétabli, remettez-le à l’endroit où il est logé, car il peut maintenant être en toute sécurité avec d’autres animaux.REMARQUE : Des analgésiques et des antibiotiques peuvent être administrés selon les recommandations du comité local d’éthique animale. 5. Imagerie d’angiographie microCT de souris Après avoir observé la souris pendant l’intervalle d’étude prédéterminé, préparez la souris à évaluer la perméabilité de l’allogreffe à l’aide d’une angiographie par microtomodensitométrie. Assurez-vous que les appareils de ventilation et d’anesthésie sont allumés pour réchauffer l’évaporateur d’isoflurane. Remplissez le réservoir d’anesthésie avec 30 mL d’isoflurane liquide et assurez-vous que le ventilateur est connecté à l’oxygène. Allumez le scanner microCT et assurez-vous que tous les logiciels fonctionnent correctement. Démarrez le logiciel d’acquisition sur le système de scanner microCT. Sur l’écran de l’unité microCT, cliquez sur Initialiser le système et choisissez le mode de tomodensitométrie. Éjectez le lit ; Fixez le lit de souris et verrouillez-le. Allumez la planche chauffante à 42 °C pour la cage de récupération. Remplir une seringue de 1 mL avec 100 μL d’agent de contraste CT. Fixez une aiguille de calibre 30 pour l’administration intraveineuse future de produit de contraste. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue. Placez une souris dans le système de retenue des veines caudales. Une fois que la souris est complètement à l’intérieur du système de retenue, fermez la porte du système, laissez la queue tomber verticalement et essuyez-la soigneusement avec une solution d’alcool (éthanol à 70 %).REMARQUE : Le succès de la canulation de la veine caudale peut être augmenté en réchauffant la queue de l’animal en la tenant dans une main gantée pendant plusieurs minutes. Saisissez la queue vers la face distale et placez deux doigts (index et milieu) autour de la queue proximale au site d’injection prévu. Placez la face distale de la queue (sous le site d’injection) entre le pouce et l’annulaire. Avec les deux paires de doigts, appliquez une légère pression et insérez l’aiguille dans la veine en utilisant une faible profondeur, en veillant à ce que la seringue et l’aiguille soient parallèles à la queue. Tout en relâchant la pression de l’index au niveau de la queue proximale, administrer l’agent de contraste CT par voie intraveineuse. Évitez l’aspiration avec la seringue car cela peut provoquer l’affaissement de la veine.REMARQUE : Aucune résistance ne doit être ressentie pendant l’injection si l’aiguille est correctement positionnée dans la veine. S’il y a une résistance, retirez l’aiguille et réinsérez-la au-dessus du site d’injection d’origine. Si la canulation de la veine échoue même après deux tentatives, remplacez l’aiguille. Après avoir réussi à injecter le produit de contraste et à retirer l’aiguille, appliquez une légère compression sur le site d’injection à l’aide d’une gaze stérile pour arrêter le saignement. Transférez la souris dans la chambre d’inhalation d’isoflurane et réglez la concentration à 2,5 % avec un débit d’oxygène de 2 mL/min et attendez 3 à 4 minutes. Une fois qu’un plan d’anesthésie a été établi, transférez rapidement la souris sur le lit du scanner microCT et posez-la en position couchée sur la table du scanner (Figure 10). Couvrez les yeux de l’animal avec la quantité appropriée de pommade ophtalmique. Placez le cône nasal de manière appropriée sur l’animal et assurez-vous que l’air et l’isoflurane circulent correctement à travers le cône nasal. Utilisez les mêmes paramètres d’anesthésie que ceux décrits précédemment (étape 5.12). Lubrifiez et insérez une sonde de température rectale pour surveiller en permanence la température corporelle de l’animal pendant l’imagerie. Placez un respirateur en contact avec la souris. Utilisez du ruban adhésif pour fixer un coussinet ECG aux membres gauche, antérieurs et gauches antérieurs et gauches. Utilisez un gel à ultrasons pour améliorer le signal entre le coussinet ECG et la peau. Vérifiez l’ECG et le signal respiratoire sur le logiciel de l’ordinateur pour vous assurer que les complexes QRS appropriés sont vus sur le moniteur. Pour ce faire, cochez la case Logic Lead (Dérivation logique ) dans l’onglet Configuration de la source et choisissez la sonde qui offre la courbe ECG la plus claire.REMARQUE : Les fils logiques correspondent aux trois électrodes ECG qui sont connectées à la hanche droite, à la poitrine gauche et au bas de la jambe. Chaque sonde représente une courbe ECG. Réglez le gain pour une hauteur de signal appropriée, généralement 4 ou 8 est bon. Sélectionnez le double déclenchement. Sous l’onglet Configuration de l’affichage, ajustez les paramètres d’affichage pour une vue claire du signal : cochez les cases à côté de ECG et REEE et réglez-les sur 500. Sous l’onglet Configuration du déclencheur, vérifiez que les canaux A, B et DualTrig sont cochés. Assurez-vous que les paramètres suivants sont également définis : Seuil : lorsque le signal tombe en dessous de cette valeur ; définissez la valeur sur 2 500 ; Hystérésis : assurez-vous que le signal traverse l’hystérésis pour créer un point de déclenchement logiciel auquel un nouveau cycle de déclenchement commence ; définissez la valeur sur 300 ; Délai : attendre avant que le déclencheur ne soit envoyé ; définissez la valeur sur 100 ; Inhiber : aucun signal ne peut être généré pendant cette période, réglez la valeur sur 200. Assurez-vous que le seuil de l’ECG est inférieur à la valeur d’hystérésis et supérieur au pic du segment sT sur l’écran d’affichage. Faites avancer l’animal dans le scanner et appuyez sur Mettre à jour l’image. Acquérir une image radiographique de l’animal afin de sélectionner le champ de vision et la couverture anatomique appropriés pour l’image microCT subséquente. Effectuez l’acquisition d’images d’angiographie microCT à l’aide des paramètres suivants : Grossissements : Ultra mise au point, Angle de balayage : Balayage complet (360), Énergie : Simple, Mode de balayage : Gated, Réglage : Par défaut (rotation complète à 360°, réglages par défaut du tube à rayons X de 0,33 mA et 55 kV, 0,750° degré par étape, 1 projection par étape, binning 1 x 1 et temps d’exposition de 40 ms ; double déclenchement signifie déclenchement cardiaque et respiratoire) (Figure 11). Une fois l’analyse terminée, transférez l’animal dans une cage de récupération préchauffée. Une fois que l’animal s’est complètement rétabli, transférez-le dans sa cage principale. Reconstruisez des images microCT à l’aide d’un logiciel système. Après avoir téléchargé l’image, réglez les barres bleues de manière à ce qu’elle chevauche la zone anatomique d’intérêt ; Prévisualisez une tranche pour réduire le volume et le contraindre le plus possible à la souris (cette étape permet de réduire la taille de l’image reconstruite). Activez le contour du volume d’intérêt pour optimiser le contour de l’image. Choisissez une taille de voxel de 40 μm, un filtre de projection de Hann et un filtre de volume gaussien (80 μm). Aller à Avancé | Déclenchement basé sur l’image et ajustez les fenêtres de déclenchement et la phase à 0,5 et 0,6, respectivement, choisissez 10 phases pour le déclenchement cardiaque, puis appuyez sur le bouton de reconstruction du volume .