マイクロコンピュータ断層撮影血管造影を用いたマウスの同所性肝移植の成功

雄のC57BL/6Jマウス(体重30g)を、全国小児病院動物施設の無病原体飼育群に収容した。すべての手順は、NIHおよびNational Research CouncilのGuide for the Humane Care and Use of Laboratory Animalsに従い、Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee(IACUCプロトコルAR17-00045)の承認を得て、人道的に実施されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。 1. 移植手術の初期設定 手術器具をセットアップします。外科的モニタリングデバイス(心拍数モニタリングデバイス、パルスオックス、モジュラーモニターシステムなど)と麻酔器をセットアップします。 可能であれば、外科用加温ボードを42°Cに加熱します。 イソフルランエバポレーターを温めるために、換気装置と麻酔装置がオンになっていることを確認してください。麻酔リザーバーに30 mLの液体イソフルランを満たし、人工呼吸器が酸素に接続されていることを確認します。.注:このプロトコルでは、動物に挿管しません。ノーズコーンは酸素化にのみ使用してください。 レシピエントマウスとドナーマウスの体重を記録します。 高倍率手術用顕微鏡の電源を入れ、外科医の好みに合わせて高さと焦点を調整します。残りの手術器具(電気焼灼装置など)の電源が入っていることを確認します。 手術器具と10-0ナイロンの手術用ネクタイを準備してレイアウトします(図2)。注:すべての手術器具は、121°Cで30分間オートクレーブ滅菌しました。さらに、手術器具の構成が異なっていても、同じように効果的である可能性があります。 門脈(PV)と総胆管(CBD)ステント用のカフを準備します(図3)。血管カテーテルとPE10を高倍率顕微鏡の下の滅菌面に置きます。#11サージカルブレードを使用して、血管カテーテルを切断し、カフ本体の上部に約0.75mmのタブが付いた長さ1.5mmのカフを形成します。ポリエチレンチューブ(PE10)を2.5mmの長さにカットします。カフとステントは、使用する準備ができるまで滅菌生理食塩水で保管します。注:この移植モデルは、20Gの血管カテーテルを使用してPV再建用のカフを作成し、CBDの再建にポリエチレンチューブ10(PE10)を使用します。他のすべての吻合は手縫いです。 ソリューションを準備します。0.5 mL のヒスチジン – トリプトファン – ケトグルタル酸 (HTK) 溶液中で 100 U で送達されるヘパリン注射を調製します。生理食塩水、ヘパリン生理食塩水、PBS、HTK保存液を氷上に保管してください。 2. ドナーマウスの調達 ドナーマウスをイソフルラン吸入チャンバーに入れることにより、麻酔を誘発します。イソフルラン濃度が約2.5%、酸素流量が2 mL/分であることを確認してください。麻酔の外科用平面が発達するまで5分待ちます。適切なレベルの麻酔を確保するには、マウスをつま先でつまんで反応を誘発します。反応の欠如は、適切なレベルの麻酔が満たされていることを示します。. 電子バリカンを使用してマウスの腹部を剃り、マウスをウォーミングボードの仰臥位に置きます。腹部をポビドンヨード、次に70%エタノールで洗浄します。乾燥を防ぐために、マウスの目の下に眼軟膏を置きます。 マウスを高倍率顕微鏡の下に置き、2 mL/分の酸素流量で2%濃度のイソフルラン吸入を使用してマウスを麻酔下に維持します。 剣状突起から恥骨結合までのハサミ(外科医の好み)で正中開腹術を行います。次に、さらに横切開を行って、肋骨より下の「十字のような」パターンを作成します。蚊の止血鉗子を使用して、剣状突起を引っ込めて、腹部内容物の適切な露出を実現します。.注:鉗子は、外科医の好みに応じて固定することができます。 腸を内臓切除し、濡れたガーゼスポンジで腹腔の左側に置きます。すべての靭帯付着物を取り除いて肝臓を動員します。 適切な肝動脈(pHA)を露出させます。カーブ鉗子を利用して血管をスケルトン化し、10-0ナイロン縫合糸で結紮します。 鋭い解剖と鈍い解剖を組み合わせて、CBDの全長を解剖します。膵臓の上縁にできるだけ近い位置で卵幹切除術(CBDステントに十分な大きさ)を行い、将来の使用に十分な長さ(肝臓の下縁から~1cm)を確保します。胆管ステントを細い鉗子でCBDに挿入し、10-0ナイロン縫合糸で固定します。10-0ナイロン縫合糸を使用してCBDの遠位面を結紮します(図4)。 濡れたガーゼスポンジを使用して右肝葉を剣状突起に向かって引っ込め、IVCを露出させます。肝下IVC(IHIVC)を後腹膜から離して動員し、ハンドヘルド焼灼装置を使用して右副腎静脈を焼灼します( 材料表を参照)。 右の腎動脈と静脈を解剖し、それぞれ7-0と10-0のナイロンで結紮します。右の腎静脈と動脈、および残りの靭帯付着部を切断します。最後に、右の腎臓を取り除きます。注:これは、最終的にIHIVCを切断するときに、露出を改善するために行われます。 0.5 mLの冷たいHTKと100 Uのヘパリン溶液をPVから30 Gのニードルで注入します。ヘパリンが体系的に分布するまで1分間待ちます。.門脈を脾臓静脈と上腸間膜静脈のすぐ上切開します。 ヘパリンを含む冷たいHTK保存液をIHIVCに30 Gの針でゆっくりと注入し、ドナーの肝臓を灌流します。PVからの液体が透明になったら、溶液の注入を停止します。注射が完了したら、右腎静脈のすぐ上のIHIVCにマイクロクランプを置き、クランプのすぐ下をカットします。このステップが完了したら、人工呼吸器をオフにし、動物が安楽死したばかりなのでイソフルランを中止します。 CBDを、ステップ2.7で留置したステントの遠位にカットします。さらに、嚢胞管を特定し、10-0ナイロン縫合糸で管を結紮します。次に、一対の鉗子で胆嚢のドームをつかみ、鋭い解剖と鈍い解剖を組み合わせて胆嚢窩から自由に解剖します。胆嚢が適切に動員されたら、スプリングハサミを使用して、以前に配置した縫合糸の上の嚢胞管を切断して胆嚢摘出術を完了します。 肝臓を下方に引っ込めて、肝上IVC(SHIVC)を露出させます。レシピエント動物の吻合に適切な長さを与えるために特別な注意を払ってSHIVCをカットします。 肝臓への追加の靭帯付着を解剖し、ドナーの肝臓を ex-vivo で送達し、臓器を冷たい生理食塩水の入った容器に入れます。 3.肝臓同種移植片のバックテーブルの準備 断熱容器に氷を入れ、氷のベッドの上にペトリ皿を置きます。ペトリ皿に冷たい生理食塩水を入れます。肝臓の同種移植片を皿に入れ、内臓表面が露出するようにします。 PVを以前に選択したカフに通し、内側の内皮表面が露出するように静脈を固定します。10-0ナイロン縫合糸で袖口を固定します。最良の結果を得るには、縫合糸がカフの溝内にあることを確認してください(図5)。 肝臓同種移植片を調整してSHIVCを露出させ、2つを8-0に配置しますナイロン製は、それぞれ3フィートと9時の向きで、レシピエント動物の最終的な吻合のために縫合します。肝臓同種移植片を再度調整してIHIVCを露出させ、2つを8-0に配置しますナイロン製は、それぞれ3フィートと9時の向きで、レシピエント動物の最終的な吻合のために縫合します。 4. 受信者の操作 注:これは無菌手術であるため、手袋と適切な個人用保護具を使用し、抗生物質を投与します。手術時に術前鎮痛剤として0.1 mg / kgブプレノルフィンを皮下投与します。. ドナー操作と同様に pHA を曝露します。前述の腹部切開の代わりに正中開腹術のみを利用します。 肝臓を動員し、すべての靭帯付着部を切断します。さらに、左横隔血管と食道傍血管を10-0ナイロン縫合糸で結紮します。 肝臓を下方に引っ込め、後腹膜からSHIVCを解剖します。次に、肝臓を上方に引っ込め、後腹膜からIHIVCを解剖します。必要に応じて、前述ののと同じ手法を使用して、小さな架橋静脈と腰椎静脈を焼灼します。. 手持ちの焼灼で右副腎静脈を焼灼し、肝門を露出させます。pHAを10-0ナイロン縫合糸でライゲーションします。次に、PVからCBDを解剖し、CBDの分岐部の近くで7-0縫合糸でCBDを結紮して、CBD吻合に十分な長さを与えます。 マイクロクランプを利用して肝下IVCをクランプし、7-0縫合糸でPVを一時的に結紮します。肝期を開始します。イソフルランの吸入を中止します。注:門脈とIVCをクランプした後、肝静脈還流は無肝段階で完全にブロックされます。吸入された麻酔薬イソフルランは肝臓で代謝されます。したがって、蓄積が心肺虚脱につながる可能性があるため、その吸入は一時的に停止します。 天然肝臓のPVから、0.5 mLのヘパリン生理食塩水を30 Gの針で注射して臓器を洗い流します。 SHIVCとIHIVCに微小血管クランプをできるだけ近位および遠位に配置して、吻合に十分な長さを残します。ネイティブSHIVC、IHIVC、PV(以前に配置した縫合糸の近く)、およびレシピエントのネイティブ肝臓に残っている靭帯付着を切断し、ネイティブ肝臓 をex vivoで送達します。注:IHIVCクランプは右腎静脈の上にある必要があります。 ドナー肝同種移植片を腹腔内に配置し、ドナー同種移植片の門部を引っ込めてPVを露出させます。空気塞栓症を避けるために、30 Gの針を使用してドナーとネイティブPVの両方を0.5 mLのヘパリン生理食塩水で洗い流し、血管の空気を抜きます。次に、以前に作成したドナーPVのカフをレシピエントの肝臓PVの内腔に挿入し、必要に応じて、吻合を助けるためにステー縫合糸を配置します(8-0縫合糸)。7-0縫合糸で吻合部を固定します(図6)。 ボードを180°回転させます。ドナーとネイティブSHIVCとの10-0ナイロン縫合糸で手縫いの吻合を行います。後壁吻合が完了したら、空気塞栓症を避けるために、0.5 mLのヘパリン生理食塩水でフラッシュして空気を抜きます。上壁の完全な吻合(図7)。 最初にPVの結紮縫合糸を取り除きます。次に、SHIVCから血管クランプを取り外して再灌流を開始します。肝相を終了し、イソフルラン吸入を再開します。.SHIVC吻合と同様に、10-0ナイロン縫合糸で手縫い吻合を行い、IHIVCを再建します。再建が完了したら、ネイティブおよびドナーIHIVCからマイクロクランプを取り外して再灌流します(図8)。 以前に配置された縫合糸の近くにレシピエントCBDにデュクトトミーを作成することにより、CBD吻合を実行します。ドナーCBDのステントをレシピエントのCBD内腔に挿入し、10-0縫合糸で吻合部を固定します(図9)。 腹腔を1mLの生理食塩水で洗浄する。止血をチェックし、残っている出血血管を焼灼します。腹部切開部を6-0縫合糸で2層に閉じます。 動物を温かいインキュベーター(42°C)に入れて回復させ、意識と十分な活動を取り戻すまで放置しないでください。手術後0.1mg/kgのブプレノルフィンを皮下投与し、術後48時間8〜12時間ごとに投与を継続する。さらに、カルプロフェン(0.2 mLを400 mLの水に溶解)をレシピエント動物の水筒から手術後最大7日間投与します。受取動物を4〜5時間観察し、完全に回復したら、他の動物と一緒に安全に過ごせるようになったため、飼育場所に戻します。注:鎮痛剤と抗生物質は、地域の動物倫理委員会の勧告に従って投与できます。 5. マウスマイクロCT血管造影イメージング 所定の研究間隔でマウスを観察した後、マイクロCT血管造影を用いて同種移植片の開存性を評価するためにマウスを準備する。 イソフルラン蒸発器を温めるために、換気装置と麻酔装置がオンになっていることを確認してください。麻酔リザーバーに30 mLの液体イソフルランを満たし、人工呼吸器が酸素に接続されていることを確認します。microCTスキャナーの電源を入れ、すべてのソフトウェアが正しく機能していることを確認します。 microCTスキャナーシステムで取得ソフトウェアを起動します。 microCTユニットのモニターで、[ システムの初期化 ]をクリックし、 CTスキャンモードを選択します。 ベッドを排出します。マウスベッドを取り付けてロックします。 回収ケージの加温ボードを42°Cにオンにします。 1 mLのシリンジに100 μLのCT造影剤を充填します。造影剤の将来の静脈内投与のために30ゲージの針を取り付けます。.シリンジに気泡がないことを確認してください。 尾静脈拘束システムにマウスを置きます。マウスが拘束装置に完全に入ったら、システムのゲートを閉じ、テールを垂直に落とし、アルコール溶液(70%エタノール)で慎重に拭きます。注:尾静脈のカニューレ挿入の成功は、手袋をはめた手で数分間保持して動物の尾を温めることによって増やすことができます。 尾部を遠位方向に向けてつかみ、2本の指(人差し指と中央)を注射予定部位の近位尾の周りに置きます。尾の遠位側(注射部位の下)を親指と薬指の間に置きます。 両方の指で少し圧力をかけ、注射器と針が尾部と平行になるように、浅い深さで針を静脈に挿入します。人差し指の圧迫を近位尾部で解放しながら、CT造影剤を静脈内投与する。シリンジによる吸引は静脈がつぶれる原因となるため避けてください。注:針が静脈に適切に配置されている場合、注射中に抵抗を感じることはありません。抵抗がある場合は、針を取り外し、元の注射部位の上に再度挿入します。.2回試みても静脈のカニューレ挿入が失敗した場合は、針を交換してください。 造影剤の注入と針の抜去に成功したら、滅菌ガーゼを使用して注射部位を穏やかに圧迫し、出血を止めます。 マウスをイソフルラン吸入チャンバーに移し、酸素流量2 mL/分で濃度を2.5%に設定し、3〜4分間待ちます。麻酔面が確立されたら、マウスをマイクロCTスキャナーベッドにすばやく移し、スキャナーテーブルのうつ伏せの位置に置きます(図10)。 適切な量の眼科用軟膏で動物の目を覆います。ノーズコーンを動物の上に適切に置き、空気とイソフルランがノーズコーンを通って適切に流れていることを確認します。前に説明したのと同じ麻酔パラメータを使用します(ステップ5.12)。直腸温度プローブに注油して挿入し、イメージング中に動物の体温を継続的に監視します。 マウスに接触するようにマスクを置きます。 テープを使用して、左、右前肢、左後肢に心電図パッドを取り付けます。超音波ジェルを使用して、ECGパッドと皮膚の間の信号を改善します。 コンピュータソフトウェアで心電図と呼吸信号をチェックして、適切なQRS複合体がモニターに表示されていることを確認します。これを行うには、[ソース設定]タブの[ロジックリード]をオンにして、最も明確なECG曲線を提供するリードを選択します。メモ: ロジックリード線は、右胸部、左胸部、下腿部に接続された 3 つの心電図パッドに対応しています。すべてのリードはECG曲線を表します。 適切な信号高さには ゲイン を設定し、通常は 4 または 8 が適切です。 デュアルゲーティングを選択します。[ ディスプレイの設定 ]タブで、 ECG と RESP の横のボックスにチェックを入れ、それぞれを500に設定します。 「Trigger Set Up 」タブで、「 Channel A」、「Channel B」、および 「DualTrig 」にチェックが入っていることを確認します。 次のパラメータも設定されていることを確認します。 しきい値:信号がこの値を下回ったとき。値を 2,500 に設定します。 ヒステリシス:信号がヒステリシスを横切るようにして、新しいトリガサイクルが開始するソフトウェアトリガポイントを作成します。値を 300 に設定します。 遅延:トリガーが送信されるまで待機します。値を 100 に設定します。 禁止:この期間中は信号を生成できないため、値を 200に設定します。 ECGの閾値がヒステリシス値を下回り、表示画面のsTセグメントのピークを上回っていることを確認します。 動物をスキャナーに進め、[ 画像の更新]を押します。動物のX線スカウト画像を取得して、その後のマイクロCT画像に適した視野と解剖学的スキャン範囲を選択します。 倍率:ウルトラフォーカス、スキャン角度:フル(360)スキャン、エネルギー:シングル、スキャンモード:ゲート、設定:デフォルト(フル360°回転、X線管のデフォルト設定は0.33mAおよび55kV、0.750°度/ステップ、1ステップあたり1投影、1×1ビニング、露光時間40ms、デュアルゲーティングは心臓と呼吸のゲーティングを意味します)(図11)。 スキャンが完了したら、動物をあらかじめ温めた回収ケージに移します。動物が完全に回復したら、元のケージに戻します。 システムソフトウェアを使用してmicroCT画像を再構成します。画像をアップロードした後、解剖学的関心領域をまたぐように青いバーを設定します。スライスをプレビューして、ボリュームを小さくし、マウスにできるだけ拘束します(この段階は、再構築された画像のサイズを小さくするのに役立ちます)。 対象ボリュームのアウトラインをオンにして、画像の境界を最適化します。40 μm のボクセル サイズ、ハン プロジェクション フィルター、ガウス ボリューム フィルター (80 μm) を選択します。[詳細設定] |画像ベースのゲーティングを行い、トリガーウィンドウと位相をそれぞれ0.5と0.6に調整し、心臓ゲーティング用に10位相を選択してから、ボリューム再構築ボタンを押します。