Успешная ортотопическая трансплантация печени мышам с использованием микрокомпьютерной томографии

Самцы мышей C57BL/6J (масса тела 30 г) содержались в условиях, свободных от патогенов, в Национальном детском госпитале для животных. Все процедуры были проведены гуманно в соответствии с NIH и Руководством Национального исследовательского совета по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и с одобрения Комитета по уходу за животными и использованию в учреждениях Национальной детской больницы (протокол IACUC AR17-00045). См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, инструментам и оборудованию, используемым в этом протоколе. 1. Первоначальная подготовка к операции по трансплантации Настройте хирургические устройства.Установите устройства для хирургического мониторинга (например, устройство для мониторинга сердечного ритма, пульс-окс, модульную систему мониторинга) и наркозные аппараты. Если возможно, включите операционную нагревательную доску до 42 °C. Убедитесь, что вентиляционные и наркозные аппараты включены для нагрева испарителя изофлурана. Наполните резервуар для анестезии 30 мл жидкого изофлурана и убедитесь, что аппарат искусственной вентиляции легких подключен к кислороду.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы не интубируем животное; Используйте только носовой обтекатель для насыщения кислородом. Запишите массу тела мышей-реципиентов и мышей-доноров. Включите мощный хирургический микроскоп и отрегулируйте высоту и фокус в соответствии с предпочтениями хирурга. Убедитесь, что остальные хирургические устройства включены (например, устройство для электрокоагуляции). Подготовьте и разложите хирургические инструменты, а также хирургические стяжки из нейлона 10-0 (рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты были автоклавированы при 121 °C в течение 30 минут. Кроме того, различные конфигурации хирургических инструментов могут быть одинаково эффективными. Подготовьте манжеты для стентов воротной вены (PV) и общего желчного протока (CBD) (рисунок 3). Поместите ангиокатетер, а также PE10 на стерильную поверхность под мощным микроскопом. Используя хирургическое лезвие #11, разрежьте ангиокатетер так, чтобы образовалась манжета длиной 1,5 мм с выступом примерно 0,75 мм в верхней части тела манжеты; Отрежьте полиэтиленовую трубку (PE10) до длины 2,5 мм. Храните манжеты и стент в стерильном физиологическом растворе до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.ПРИМЕЧАНИЕ: В этой модели трансплантации используется ангиокатетер 20 G для изготовления манжет для реконструкции ФВ, а также полиэтиленовая трубка 10 (PE10) для реконструкции КБД. Все остальные анастомозы пришиваются вручную. Приготовьте растворы. Приготовьте инъекцию гепарина, которая будет вводиться при 100 ЕД в 0,5 мл раствора гистидин-триптофан-кетоглутарата (ГТК). Храните физиологический раствор, гепарин-солевой раствор, ПБС и консервирующий раствор HTK на льду. 2. Закупка донорских мышей Индуцируйте анестезию у мыши-донора, поместив ее в ингаляционную камеру с изофлураном. Убедитесь, что концентрация изофлурана составляет примерно 2,5% при потоке кислорода 2 мл/мин. Подождите 5 минут, пока не разовьется хирургическая плоскость анестезии. Чтобы обеспечить надлежащий уровень анестезии, зажмите мышь пальцем ноги, чтобы вызвать реакцию; Отсутствие реакции свидетельствует о том, что был соблюден надлежащий уровень анестезии. Побрейте живот мыши с помощью электронных машинок для стрижки и поместите мышь в положение лежа на грелке. Очистите брюшную полость повидон-йодом, затем 70% этиловым спиртом. Наносите офтальмологическую мазь под глаза мышей, чтобы предотвратить сухость. Поместите мышь под мощный микроскоп и держите мышь под наркозом, используя ингаляцию изофлурана 2% концентрации с потоком кислорода 2 мл/мин. Выполните срединную лапаротомию ножницами (предпочтительно хирургу) от мечевидного отростка до лобкового симфиза. Затем выполните дополнительный поперечный разрез для создания «крестообразного» рисунка ниже ребер. Используя гемостатические щипцы для комаров, втяните мечевидный отросток, чтобы добиться адекватного обнажения содержимого брюшной полости.ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы могут быть закреплены в зависимости от предпочтений хирурга. Выпотрошите кишечник и поместите его с левой стороны брюшной полости во влажную марлевую губку. Мобилизуйте печень, удалив все связочные прикрепления. Обнажите соответствующую печеночную артерию (рГА). Скелетизируйте сосуд с помощью изогнутых щипцов и наложите на него нейлоновый шов 10-0. Рассеките КБД по всей длине, используя комбинацию острого и тупого рассечения. Выполните дуктотомию (достаточно большую для стента CBD) как можно ближе к верхней границе поджелудочной железы, чтобы обеспечить достаточную длину для будущего использования (~1 см от нижней границы печени). Вставьте стент желчного протока в CBD тонкими щипцами и закрепите его нейлоновым швом 10-0. Лигируйте дистальную часть КБД с помощью нейлонового шовного материала 10-0 (Рисунок 4). Втяните правую долю печени по направлению к мечевидному отростку с помощью влажной марлевой губки и обнажите НПВ. Мобилизуйте подпеченочный НПВ (IHIVC) подальше от забрюшинного пространства и прижгите правую надпочечниковую вену с помощью ручного устройства для прижигания (см. таблицу материалов). Рассекают правую почечную артерию и вену и перевязывают нейлоном 7-0 и 10-0 соответственно. Перерезать правую почечную вену и артерию, а также оставшиеся прикрепления связок. Наконец, удалите правую почку.ПРИМЕЧАНИЕ: Это сделано для того, чтобы иметь лучшую экспозицию при окончательном разрезании IHIVC. Ввести 0,5 мл холодного HTK с раствором гепарина 100 ЕД через ПВ иглой 30 G. Подождите 1 минуту, пока гепарин не распределится систематически. Перерезают воротную вену чуть выше селезеночной вены и верхнебрыжеечную вену. Медленно вводят холодный консервирующий раствор HTK с гепарином в IHIVC иглой 30 G для перфузии донорской печени. Прекратите впрыскивание раствора, как только жидкость, поступающая из PV, станет прозрачной. После того, как инъекция будет завершена, наложите микрозажим на IHIVC чуть выше правой почечной вены и разрежьте чуть ниже зажима. Как только этот шаг будет завершен, выключите аппарат искусственной вентиляции легких и прекратите прием изофлурана, так как животное только что было подвергнуто эвтаназии. Разрежьте КБД дистально по отношению к стенту, который ранее был установлен на шаге 2.7. Кроме того, определите пузырный проток и перевяжите его нейлоновым швом 10-0. Затем обхватите купол желчного пузыря щипцами и рассеките его из ямки желчного пузыря, используя комбинацию острого и тупого рассечения. После того, как желчный пузырь будет адекватно мобилизован, с помощью пружинных ножниц завершите холецистэктомию, перерезав пузырный проток над ранее наложенным швом. Втяните печень вниз, чтобы обнажить надпеченочный НПВ (SHIVC). Разрежьте SHIVC, уделяя особое внимание тому, чтобы обеспечить достаточную длину для анастомоза у животного-реципиента. Рассекают свободные дополнительные связочные прикрепления к печени и доставляют донорскую печень ex-vivo и помещают орган в контейнер с холодным физиологическим раствором. 3. Заготовка аллотрансплантата печени Поместите лед в изолированный контейнер и поставьте чашку Петри на подушку со льдом. Наполните чашку Петри холодным физиологическим раствором. Поместите аллотрансплантат печени в чашку так, чтобы обнажилась висцеральная поверхность. Поместите ПВ через ранее выбранную манжету и выверните вену так, чтобы обнажилась внутренняя эндотелиальная поверхность. Закрепите манжету нейлоновым швом 10-0. Убедитесь, что шов находится в бороздках манжеты для достижения наилучших результатов (Рисунок 5). Отрегулируйте аллотрансплантат печени, чтобы обнажить SHIVC и разместить два 8-0 Нейлоновые швы в положении 3′ и 9 часов соответственно для возможного анастомоза у животного-реципиента. Отрегулируйте аллотрансплантат печени еще раз, чтобы обнажить IHIVC, и поместите два 8-0 Нейлоновые швы в положении 3′ и 9 часов соответственно для возможного анастомоза у животного-реципиента. 4. Операция получателя ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это стерильная операция, используйте перчатки и надлежащие средства индивидуальной защиты и вводите антибиотики. Вводят 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно в качестве предоперационной анальгезии во время операции. Экспонировать рГК, как при донорской операции; Используйте только срединную лапаротомию вместо ранее описанного разреза брюшной полости. Мобилизуйте печень и перережьте все связочные прикрепления. Дополнительно перевязать левый диафрагмальный и параэзофагеальный сосуды нейлоновым швом 10-0. Втягивают печень снизу и рассекают свободный SHIVC из забрюшинного пространства. Затем втягивают печень сверху и рассекают свободный IHIVC из забрюшинного пространства. При необходимости прижигайте мелкие мостиковые вены и поясничные вены, используя ту же технику, что и выше. Прижгите правую надпочечниковую вену ручным прижиганием и обнажите печеночную рубчик. Лигируйте pHA нейлоновым шовным материалом 10-0. Затем рассеките КБД свободным от ФВ и перевязайте КБД швом 7-0 близко к бифуркации КБД, чтобы обеспечить достаточную длину для анастомоза КБД. Используйте микрозажим для пережатия внутрипеченочного НВК и временно перевязайте ВП швом 7-0. Начните печеночную фазу. Прекратите ингаляцию изофлурана.ПРИМЕЧАНИЕ: После пережатия воротной вены и НПВ печеночный венозный возврат полностью блокируется в стадии печени. Ингаляционный анестетик изофлуран метаболизируется печенью; Таким образом, его вдыхание на мгновение прекращается, так как накопление может привести к сердечно-легочному коллапсу. Через нативный ПВ печени ввести 0,5 мл гепарин-физраствора иглой 30 г для промывания органа. Наложите микрососудистые зажимы на SHIVC и IHIVC как можно ближе и дистальнее, чтобы оставить достаточную длину для анастомоза. Разрежьте нативный SHIVC, IHIVC, PV (близко к ранее наложенному шву) и любые оставшиеся связочные прикрепления к родной печени реципиента и доставьте нативную печень ex vivo.ПРИМЕЧАНИЕ: Зажим IHIVC должен быть выше правой почечной вены. Поместите донорский аллотрансплантат печени внутрь брюшной полости и втяните подвздошную кость донорского аллотрансплантата, чтобы обнажить ВП. Промойте донорскую и нативную ПВ 0,5 мл гепаринового физиологического раствора с помощью иглы 30 г, чтобы обесвоздухить сосуды, чтобы избежать воздушной эмболии. Затем вводят ранее изготовленную манжету донорского ВП в просвет печени реципиента ВП и при необходимости накладывают швы, чтобы облегчить анастомоз (шов 8-0). Закрепите анастомоз швом 7-0 (Рисунок 6). Поверните доску на 180°. Выполнить ручной анастомоз нейлоновым швом 10-0 с донором и нативным SHIVC. После завершения анастомоза задней стенки промыть 0,5 мл гепаринового раствора для опорожнения воздуха, чтобы избежать воздушной эмболии. Полный анастомоз верхней стенки (рис. 7). Сначала снимите лигирующий шов ПВ; затем снимите сосудистые зажимы с SHIVC, чтобы начать реперфузию. Завершите печеночную фазу и возобновите ингаляцию изофлурана. Выполнить ручной анастомоз нейлоновым швом 10-0 таким же образом, как и для анастомоза SHIVC, для реконструкции IHIVC. После завершения реконструкции снимают микрозажим с нативного и донорского IHIVC для реперфузии (рис. 8). Выполните анастомоз CBD, создав дуктотомию на реципиенте CBD рядом с ранее наложенным швом. Вставьте стент в просвет КБД донора в просвет КБД реципиента и закрепите анастомоз швом 10-0 (Рисунок 9). Орошать брюшную полость 1 мл физиологического раствора; Проверьте гемостаз и прижгите оставшиеся кровоточащие сосуды. Закрыть разрез брюшной полости в два слоя, наложив шов 6-0. Поместите животное в теплый инкубатор (42 °C) для восстановления и не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание и не станет достаточно активным. Вводите 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно после операции и продолжайте введение каждые 8-12 часов в течение 48 часов после операции. Кроме того, вводите карпрофен (0,2 мл, растворенный в 400 мл воды) через бутылку с водой животного-реципиента в течение 7 дней после операции. Понаблюдайте за животным-реципиентом в течение 4-5 часов, а когда оно полностью выздоровеет, верните его в место содержания, так как теперь находиться с другими животными безопасно.ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивающие препараты и антибиотики могут назначаться в соответствии с рекомендациями местного комитета по этике животных. 5. МикроКТ-ангиография мыши После наблюдения за мышью в течение заданного интервала исследования подготовьте мышь к оценке проходимости аллотрансплантата с помощью микроКТ-ангиографии. Убедитесь, что аппараты вентиляции и анестезии включены для нагрева испарителя изофлурана. Наполните резервуар для анестезии 30 мл жидкого изофлурана и убедитесь, что аппарат искусственной вентиляции легких подключен к кислороду. Включите микрокомпьютерный томограф и убедитесь, что все программное обеспечение работает правильно. Запустите программное обеспечение для сбора данных на системе микрокомпьютерного томографа. На мониторе аппарата микроКТ нажмите «Инициализировать систему » и выберите режим компьютерной томографии. Выдвиньте кровать; Прикрепите лежанку для мыши и зафиксируйте ее. Включите нагревательную доску до 42 °C для клетки для восстановления. Наполните шприц объемом 1 мл 100 мкл контрастного вещества для КТ. Прикрепите иглу 30-го калибра для дальнейшего внутривенного введения контрастного вещества. Следите за тем, чтобы в шприце не было пузырьков воздуха. Поместите мышь в систему удержания хвостовой вены. Как только мышь полностью окажется внутри удерживающей системы, закройте затвор системы, позвольте хвосту опуститься вертикально и тщательно протрите его спиртовым раствором (70% этанол).ПРИМЕЧАНИЕ: Успех канюляции хвостовой вены можно увеличить, согрев хвост животного, подержав его в руке в перчатке в течение нескольких минут. Возьмитесь за хвост по направлению к дистальному отделу и поместите два пальца (указательный и средний) вокруг хвоста проксимальнее планируемого места инъекции. Поместите дистальную часть хвоста (ниже места инъекции) между большим и безымянным пальцами. Обеими парами пальцев слегка надавите и введите иглу в вену на небольшую глубину, следя за тем, чтобы шприц и игла были параллельны хвосту. Ослабляя давление указательного пальца на проксимальном отделе хвоста, внутривенно вводят контрастное вещество для КТ. Избегайте аспирации с помощью шприца, так как это может привести к коллапсу вены.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции не должно ощущаться никакого сопротивления, если игла правильно расположена в вене. Если есть сопротивление, извлеките иглу и снова вставьте ее над первоначальным местом инъекции. Если канюляция вены не удалась даже после двух попыток, замените иглу. После успешного введения контрастного вещества и извлечения иглы приложите легкий компресс к месту инъекции с помощью стерильной марли, чтобы остановить кровотечение. Перенесите мышь в ингаляционную камеру изофлурана и установите концентрацию 2,5% при потоке кислорода 2 мл/мин и подождите 3-4 мин. После того, как плоскость анестезии установлена, быстро перенесите мышь на станину микрокомпьютерного томографа и положите ее в положении лежа на столе сканера (рис. 10). Закройте глаза животного необходимым количеством офтальмологической мази. Наденьте носовой обтекатель на животное надлежащим образом и убедитесь, что воздух и изофлуран правильно проходят через носовой конус. Используйте те же параметры анестезии, которые были описаны ранее (шаг 5.12). Смажьте и вставьте ректальный датчик температуры для непрерывного мониторинга температуры тела животного во время визуализации. Поместите респиратор в контакт с мышью. С помощью ленты прикрепите прокладку для ЭКГ к левой, правой передней и левой задним конечностям. Используйте гель для ультразвука, чтобы улучшить сигнал между прокладкой ЭКГ и кожей. Проверьте ЭКГ и дыхательный сигнал в компьютерном программном обеспечении, чтобы убедиться, что на мониторе отображаются правильные комплексы QRS. Для этого установите флажок «Логический вывод » на вкладке «Настройка источника » и выберите провод с наиболее четкой кривой ЭКГ.ПРИМЕЧАНИЕ: Логические провода соответствуют трем прокладкам ЭКГ, которые подключены к правой, левой грудной клетке и голени. Каждый отведение представляет собой кривую ЭКГ. Установите усиление для правильной высоты сигнала, обычно 4 или 8 хорошо. Выберите двойное стробирование. На вкладке «Настройка дисплея» настройте параметры дисплея для четкого отображения сигнала: установите флажки рядом с пунктами «ЭКГ» и «RESP» и установите для каждого значение 500. На вкладке «Настройка триггера» убедитесь, что установлены флажки «Канал A», «Канал B» и «DualTrig». Убедитесь, что также установлены следующие параметры: Порог: когда сигнал падает ниже этого значения; установите значение 2,500; Гистерезис: убедитесь, что сигнал пересекает гистерезис, чтобы создать программную триггерную точку, в которой начинается новый цикл запуска; установите значение 300; Delay: подождать перед отправкой триггера; установите значение 100; Inhibit: в течение этого периода не может быть сгенерирован сигнал, установите значение 200. Следите за тем, чтобы порог для ЭКГ был ниже значения гистерезиса и выше пика сегмента sT на экране дисплея. Переместите животное в сканер и нажмите Обновить изображение. Сделайте рентгеновский снимок животного, чтобы выбрать подходящее поле зрения и анатомическое покрытие для последующего микроКТ-изображения. Выполняйте получение изображений микроКТ-ангиографии со следующими параметрами: Увеличение: Ультрафокус, Угол сканирования: Полное (360) сканирование, Энергия: Одиночное, Режим сканирования: Стробированный, Настройка: По умолчанию (полное вращение на 360°, настройки рентгеновской трубки по умолчанию 0,33 мА и 55 кВ, 0,750° градуса на шаг, 1 проекция на шаг, 1 x 1 биннинг и время экспозиции 40 мс; двойное стробирование означает стробирование сердца и дыхания) (Рисунок 11). После завершения сканирования переведите животное в предварительно разогретую клетку для восстановления. Как только животное полностью выздоровеет, переведите его обратно в основную клетку. Реконструировать микроКТ-снимки с помощью системного программного обеспечения. После загрузки изображения установите синие полосы так, чтобы оно охватывало анатомическую область интереса; Предварительный просмотр фрагмента, чтобы уменьшить объем и максимально ограничить его мышью (этот этап помогает уменьшить размер восстановленного изображения). Включите контур интересующего объема, чтобы оптимизировать границу изображения. Выберите размер вокселя 40 мкм, проекционный фильтр Ханна и объемный фильтр Гаусса (80 мкм). Перейти в раздел «Дополнительно» | Стробирование на основе изображения и настройка окон запуска и фазы на 0,5 и 0,6 соответственно, выберите 10 фаз для стробирования сердца, а затем нажмите кнопку восстановления объема .