Summary

Transplante Ortotópico de Fígado em Camundongos Utilizando Angiotomografia Microcomputadorizada

Published: September 22, 2023
doi:

Summary

Neste protocolo, discutimos a implementação de um modelo de transplante ortotópico de fígado (THO) bem-sucedido em camundongos. Além disso, são discutidos também os adjuvantes para analisar melhor a patência do aloenxerto após o sucesso do TOL em camundongos, especificamente utilizando exames de microtomografia computadorizada (microTC).

Abstract

A angiotomografia computadorizada (microTC) é um recurso inestimável para os pesquisadores. Novos avanços nessa tecnologia têm permitido a obtenção de imagens de alta qualidade da microvasculatura e são ferramentas de alta fidelidade no campo dos transplantes de órgãos. Neste modelo de transplante ortotópico de fígado (THO) em camundongos, a microTC oferece a oportunidade de avaliar a anastomose do aloenxerto em tempo real e tem o benefício adicional de não ter que sacrificar os animais do estudo. A escolha do contraste, bem como as configurações de aquisição da imagem, criam uma imagem de alta definição, que fornece aos pesquisadores informações inestimáveis. Isso permite avaliar os aspectos técnicos do procedimento, bem como potencialmente avaliar diferentes terapêuticas ao longo de um longo período de tempo. Neste protocolo, detalhamos um modelo de TQO em camundongos de forma passo a passo e, finalmente, descrevemos um protocolo de microTC que pode fornecer imagens de alta qualidade, que auxiliam os pesquisadores na análise aprofundada de transplantes de órgãos sólidos. Fornecemos um guia passo-a-passo para o transplante hepático em camundongo, bem como discutimos brevemente um protocolo para avaliação da perviedade do enxerto através da angiotomografia.

Introduction

O transplante é a única terapia eficaz para a doença hepática terminal. Inegavelmente, o benefício do transplante hepático é excelente, com sobrevida mediana de 11,6 anos versus 3,1 anos na lista de espera1. No entanto, existem restrições significativas, que limitam a ampla aplicação do transplante hepático e incluem, o mais importante, a falta de órgãos de doadores adequados e de alta qualidade. A ampliação do pool de órgãos doados exigirá, portanto, estratégias inovadoras que permitam a utilização de aloenxertos hoje considerados inadequados, aumentando a margem de segurança para o transplante. Portanto, para melhorar o acesso ao transplante hepático, é imperativo realizar estudos pré-clínicos em pequenos animais.

Particularmente importantes para a pesquisa em transplantes são os modelos in vivo de transplante. O transplante ortotópico de fígado (TOF) em camundongos existe há quase 30 anos2 e é vital para o estudo de muitos aspectos do transplante, incluindo a caracterização da resposta imune, lesão de isquemia-reperfusão, rejeição aguda, efeitos terapêuticos de novos agentes e sobrevida em longo prazo 3,4,5,6,7 . O uso de camundongos para estudar o transplante é vital, pois permite o uso de linhagens de camundongos transgênicos para estudar o impacto de vias moleculares específicas nos resultados do transplante. Protocolos estabelecidos de transplante hepático em camundongos foram bem descritospreviamente8,9.

Existem múltiplos métodos de anastomoses para a veia cava inferior (VCI) supra e infra-hepática, veia porta (VP) e via biliar comum (CBD). Geralmente dependem de anastomose das mãos ou de uma técnica modificada de manguito vascular semelhante ao transplante de pulmão murino 10,11,12. Um passo importante no estudo a longo prazo e na sobrevivência dos camundongos receptores, bem como no desenvolvimento de um programa sustentado de transplante de fígado em camundongos, é a capacidade de avaliar essas anastomoses críticas. As modalidades de imagem para avaliar a perviedade do enxerto hepático geralmente dependem da ultrassonografia e da tomografia computadorizada (TC) no contexto clínico13,14. A TC tem uma vantagem distinta sobre a ultrassonografia, pois pode oferecer vistas de todo o abdome para incluir todas as anastomoses, embora a obtenção dessas visualizações com ultrassonografia possa ser particularmente difícil em pequenos animais. Pesquisas e recursos significativos têm sido dedicados ao desenvolvimento de microTC acurada com o objetivo de aprimorar os estudos em animais e as informações que podemos obter desses modelos de lesão e doença15,16. Descrevemos brevemente um protocolo de transplante ortotópico de fígado em camundongos (Figura 1) e descrevemos brevemente um protocolo de microTC para avaliar a perviedade do aloenxerto e a durabilidade das anastomoses.

Protocol

Camundongos C57BL/6J machos (30 g de peso corporal) foram alojados em condições livres de patógenos no Nationwide Children’s Hospital Animal Facility. Todos os procedimentos foram realizados humanamente de acordo com o NIH e o National Research Council’s Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals e com a aprovação do Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol AR17-00045). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e equipamentos usados neste protocolo. 1. Configuração inicial para a cirurgia de transplante Configurar dispositivos cirúrgicos.Configure dispositivos de monitoramento cirúrgico (ou seja, dispositivo de monitoramento de frequência cardíaca, pulso-ox, sistema de monitoramento modular) e aparelhos de anestesia. Se disponível, ligue a placa de aquecimento cirúrgica a 42 °C. Certifique-se de que os aparelhos de ventilação e anestesia estejam ligados para aquecer o evaporador de isoflurano. Encher o reservatório de anestesia com 30 mL de isoflurano líquido e garantir que a máquina do ventilador esteja conectada ao oxigênio.OBS: Neste protocolo, não intubamos o animal; Use apenas um cone nasal para oxigenação. Registre o peso corporal dos camundongos receptores e doadores. Ligue o microscópio cirúrgico de alta potência e ajuste a altura e o foco de acordo com as preferências do cirurgião. Certifique-se de que os dispositivos cirúrgicos restantes estejam ligados (ou seja, dispositivo de eletrocautério). Preparar e dispor instrumentais cirúrgicos, bem como laços cirúrgicos de náilon 10-0 (Figura 2).OBS: Todos os instrumentais cirúrgicos foram autoclavados a 121 °C por 30 min. Além disso, diferentes configurações de instrumentais cirúrgicos poderiam ser igualmente eficazes. Preparar os manguitos para os stents da veia porta (VP) e do ducto biliar comum (CBD) (Figura 3). Colocar o cateter angio, bem como o PE10, em uma superfície estéril sob o microscópio de alta potência. Usando uma lâmina cirúrgica #11, corte o cateter angiodinâmico para formar um manguito de 1,5 mm de comprimento com uma aba de aproximadamente 0,75 mm na parte superior do corpo do manguito; cortar a tubulação de polietileno (PE10) para 2,5 mm de comprimento. Armazenar os manguitos e o stent em soro fisiológico estéril até que estejam prontos para uso.NOTA: Este modelo de transplante utiliza um cateter angiocateter 20G para confecção de manguitos para reconstrução de PV, bem como um tubo de polietileno 10 (PE10) para a reconstrução do CBD. Todas as outras anastomoses são costuradas à mão. Preparar soluções. Preparar uma injeção de heparina que será administrada a 100 U em 0,5 mL de solução de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK). Armazenar soro fisiológico, heparina-salina, PBS, e solução de preservação HTK no gelo. 2. Aquisição de ratos doadores Induzir anestesia no camundongo doador colocando-o em uma câmara de inalação de isoflurano. Certifique-se de que a concentração de isoflurano é de aproximadamente 2,5% com um fluxo de oxigênio de 2 mL/min. Aguarde 5 min para que um plano cirúrgico de anestesia se desenvolva. Para garantir o nível adequado de anestesia, aperte o mouse para provocar uma reação; A falta de reação indica que o nível adequado de anestesia foi atingido. Faça a barba do abdômen do mouse usando cortadores eletrônicos e coloque o mouse na posição supina na placa de aquecimento. Limpe o abdômen com iodopovidona, depois etanol 70%. Coloque pomada oftálmica sob os olhos dos ratos para evitar o ressecamento. Colocar o camundongo sob o microscópio de alta potência e mantê-lo sob anestesia usando uma inalação de isoflurano de concentração de 2% com um fluxo de oxigênio de 2 mL/min. Realizar laparotomia mediana com tesoura (preferência do cirurgião) desde o processo xifoide até a sínfise púbica. Em seguida, realize uma incisão transversal adicional para criar um padrão “tipo cruz” inferior às costelas. Usando pinças hemostáticas de mosquito, retrair o processo xifoide para obter exposição adequada do conteúdo abdominal.NOTA: A pinça pode ser fixada dependendo da preferência do cirurgião. Eviscerar os intestinos e colocá-los no lado esquerdo da cavidade abdominal em uma esponja de gaze molhada. Mobilize o fígado retirando todos os anexos ligamentares. Expor a artéria hepática adequada (pHA). Esqueletizar o vaso utilizando pinça curva e ligá-lo com fio de náilon 10-0. Disseque todo o comprimento do CBD usando uma combinação de dissecção nítida e contundente. Realizar uma ductotomia (grande o suficiente para o stent CBD) o mais próximo possível da borda superior do pâncreas para dar um comprimento adequado para uso futuro (~1 cm da borda inferior do fígado). Insira o stent do ducto biliar no CBD com pinça fina e fixe-o com uma sutura de náilon 10-0. Ligate a face distal do CBD com fio de náilon 10-0 (Figura 4). Retrair o lobo hepático direito em direção ao xifoide usando uma esponja de gaze úmida e expor a VCI. Mobilizar a VCI infra-hepática (IHIVC) para longe do retroperitônio e cauterizar a veia adrenal direita usando um dispositivo de cautério portátil (ver Tabela de Materiais). Dissecar a artéria e veia renais direitas e ligar com náilon 7-0 e 10-0, respectivamente. Cortar a veia e artéria renais direitas e anexos ligamentares remanescentes. Finalmente, remova o rim direito.NOTA: Isso é feito para ter melhor exposição ao finalmente cortar o IHIVC. Injetar 0,5 mL de HTK frio com solução de heparina 100 U através do PV com uma agulha de 30 G. Aguarde 1 min para que a heparina se distribua sistematicamente. Corte a veia porta logo superior à veia esplênica e veia mesentérica superior. Injetar lentamente solução fria de preservação de HTK com heparina no IHIVC com uma agulha de 30 G para perfundir o fígado do doador. Pare de injetar a solução quando o fluido proveniente do PV estiver límpido. Após a injeção, coloque uma micropinça no IHIVC logo superior à veia renal direita e corte logo inferiormente à pinça. Concluída essa etapa, desligue o ventilador e pare com o isoflurano, pois o animal acabou de ser eutanasiado. Cortar o CBD distalmente ao stent que foi previamente colocado no passo 2.7. Além disso, identificar o ducto cístico e ligadura do ducto com fio de náilon 10-0. Em seguida, segure a cúpula da vesícula biliar com um par de pinças e disseque livre da fossa da vesícula biliar usando uma combinação de dissecção afiada e romba. Uma vez que a vesícula biliar esteja adequadamente mobilizada, usando uma tesoura de mola, complete a colecistectomia cortando o ducto cístico acima da sutura previamente colocada. Retrair o fígado inferiormente para expor a VCI supra-hepática (CVSI). Corte o SHIVC prestando especial atenção para dar um comprimento adequado para a anastomose no animal receptor. Disseque os anexos ligamentares adicionais livres para o fígado e entregar o fígado do doador ex-vivo e colocar o órgão em um recipiente com soro fisiológico frio. 3. Preparo da mesa traseira do aloenxerto hepático Coloque gelo em um recipiente isolado e coloque uma placa de Petri no leito de gelo. Encha a placa de Petri com soro fisiológico gelado. Coloque o aloenxerto de fígado na placa para que a superfície visceral fique exposta. Colocar o PV através do manguito previamente selecionado e everter a veia de modo que a superfície endotelial interna fique exposta. Fixar o manguito com fio de náilon 10-0. Certifique-se de que a sutura fique dentro dos sulcos do manguito para obter os melhores resultados (Figura 5). Ajustar o aloenxerto hepático para expor o SHIVC e colocar dois 8-0 suturas de náilon às 3′ e 9 horas, respectivamente, para eventual anastomose no animal receptor. Ajustar novamente o aloenxerto hepático para expor o IHIVC e colocar dois 8-0 suturas de náilon às 3′ e 9 horas, respectivamente, para eventual anastomose no animal receptor. 4. Operação do destinatário OBS: Como se trata de uma operação estéril, utilizar luvas e equipamentos de proteção individual adequados e administrar antibióticos. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea como analgesia pré-operatória no momento da cirurgia. Expor o pHA como na operação do doador; utilizar apenas uma laparotomia mediana em vez da incisão abdominal descrita anteriormente. Mobilizar o fígado e cortar todos os anexos ligamentares. Além disso, ligadura dos vasos frênicos e paraesofágicos esquerdos com fio de náilon 10-0. Retrair o fígado inferiormente e dissecar liberar a SHIVC do retroperitônio. Em seguida, retrair superiormente o fígado e dissecar o IHIVC do retroperitônio. Cauterizar pequenas veias em ponte e veias lombares, conforme necessário, usando a mesma técnica descrita anteriormente. Cauterizar a veia adrenal direita com cautério manual e expor o hilo hepático. Ligate o pHA com fio de náilon 10-0. Em seguida, dissecar o CBD livre do PV e ligar o CBD com sutura 7-0 próximo à bifurcação do CBD para dar um comprimento adequado para a anastomose do CBD. Utilizar uma micropinça para pinçar a VCI infra-hepática e ligar temporariamente o PV com uma sutura 7-0. Iniciar a fase an-hepática. Parar a inalação de isoflurano.NOTA: Após o pinçamento da veia porta e da VCI, o retorno venoso hepático é completamente bloqueado na fase anepática. O anestésico inalatório isoflurano é metabolizado pelo fígado; assim, sua inalação é momentaneamente interrompida, pois o acúmulo pode levar ao colapso cardiopulmonar. Através da PV do fígado nativo, injetar 0,5 mL de solução salina de heparina com uma agulha de 30 G para lavar o órgão. Colocar pinças microvasculares no SHIVC e IHIVC o mais proximal e distalmente possível para deixar um comprimento adequado para a anastomose. Cortar o SHIVC, IHIVC, PV nativo (próximo à sutura previamente colocada) e quaisquer anexos ligamentares remanescentes ao fígado nativo do receptor e entregar o fígado nativo ex vivo.NOTA: A pinça IHIVC deve estar acima da veia renal direita. Colocar o aloenxerto hepático do doador dentro da cavidade abdominal e retrair o hilo do aloenxerto do doador para expor as VVPP. Lave o PV doador e o PV nativo com 0,5 mL de solução salina de heparina usando uma agulha de 30 G para desarejar os vasos para evitar embolia gasosa. Em seguida, inserir o manguito previamente confeccionado do PV do doador na luz do PV hepático receptor e, se necessário, colocar suturas de permanência para auxiliar na anastomose (sutura 8-0). Fixar a anastomose com sutura 7-0 (Figura 6). Gire a placa em 180°. Realizar anastomose feita à mão com fio de náilon 10-0 com o doador e o SHIVC nativo. Após completar a anastomose de parede posterior, lavar com 0,5 mL de solução salina de heparina para desarejar para evitar embolia gasosa. Anastomose completa da parede superior (Figura 7). Remover primeiro a sutura de ligadura do PV; em seguida, remova as pinças vasculares do SHIVC para iniciar a reperfusão. Finalizar a fase an-hepática e reiniciar a inalação de isoflurano. Realizar anastomose de costura manual com fio de náilon 10-0, da mesma forma que para a anastomose SHIVC, para reconstrução do IHIVC. Após o término da reconstrução, retirar a micropinça do IHIVC nativo e doador para reperfusão (Figura 8). Realizar a anastomose do CBD criando uma ductotomia no CBD receptor próximo à sutura previamente colocada. Inserir o stent no CBD doador na luz do CBD do receptor e fixar a anastomose com sutura 10-0 (Figura 9). Irrigar a cavidade abdominal com 1 mL de soro fisiológico; verificar a hemostasia e cauterizar os vasos sangrantes remanescentes. Fechar a incisão abdominal em duas camadas utilizando sutura 6-0. Coloque o animal em uma incubadora aquecida (42 °C) para recuperação e não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência e atividade suficiente. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea após a cirurgia e continuar a administração a cada 8 a 12 horas por 48 horas após a cirurgia. Além disso, administrar carprofeno (0,2 mL dissolvido em 400 mL de água) através da garrafa de água do animal receptor por até 7 dias após a cirurgia. Observe o animal receptor por 4-5 h e, uma vez que ele tenha se recuperado totalmente, devolva-o ao local de alojamento, pois agora é seguro estar com outros animais.NOTA: Medicamentos para dor e antibióticos podem ser administrados de acordo com as recomendações do comitê de ética animal local. 5. Imagem de angiotomografia em camundongos Depois de observar o camundongo para o intervalo de estudo pré-determinado, prepare o camundongo para avaliar a patência do aloenxerto usando angiotomografia. Certifique-se de que os aparelhos de ventilação e anestesia estejam ligados para aquecer o evaporador de isoflurano. Encher o reservatório de anestesia com 30 mL de isoflurano líquido e garantir que a máquina do ventilador esteja conectada ao oxigênio. Ligue o scanner de microtomografia computadorizada e verifique se todo o software está funcionando corretamente. Inicie o software de aquisição no sistema do scanner de microtomografia. No monitor da unidade de microCT, clique em Inicializar sistema e escolha Modo de tomografia computadorizada. Ejetar a cama; Conecte a cama do mouse e bloqueie-a. Ligue a placa de aquecimento a 42 °C para a gaiola de recuperação. Preencher uma seringa de 1 mL com 100 μL de contraste CT. Anexar uma agulha de calibre 30 para futura administração intravenosa de contraste. Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa. Coloque um rato no sistema de retenção da veia caudal. Quando o mouse estiver completamente dentro do sistema de retenção, feche o portão do sistema, deixe a cauda cair verticalmente e limpe-a cuidadosamente com uma solução de álcool (etanol 70%).NOTA: O sucesso na canulação da veia da cauda pode ser aumentado aquecendo a cauda do animal segurando-a em uma mão enluvada por vários minutos. Segure a cauda em direção ao aspecto distal e coloque dois dedos (indicador e médio) ao redor da cauda proximal ao local de injeção planejado. Coloque o aspecto distal da cauda (abaixo do local da injeção) entre o polegar e o dedo anelar. Com ambos os conjuntos de dedos, aplique uma leve pressão e insira a agulha na veia usando uma profundidade rasa, garantindo que a seringa e a agulha fiquem paralelas à cauda. Ao liberar a pressão do dedo indicador na cauda proximal, administre o contraste por via intravenosa. Evite a aspiração com a seringa, pois isso pode causar o colapso da veia.NOTA: Nenhuma resistência deve ser sentida durante a injeção se a agulha estiver adequadamente posicionada na veia. Se houver resistência, remova a agulha e volte a inseri-la acima do local de injeção original. Se a canulação da veia falhar mesmo após duas tentativas, substitua a agulha. Depois de injetar com sucesso o contraste e remover a agulha, aplique uma compressão suave no local da injeção usando gaze estéril para parar o sangramento. Transfira o camundongo para a câmara de inalação de isoflurano e ajuste a concentração para 2,5% com um fluxo de oxigênio de 2 mL/min e aguarde 3-4 min. Uma vez estabelecido um plano de anestesia, transferir rapidamente o mouse para o leito do microtomógrafo e colocá-lo em decúbito ventral na mesa do scanner (Figura 10). Cubra os olhos do animal com a quantidade adequada de pomada oftálmica. Coloque o cone nasal adequadamente sobre o animal e certifique-se de que o ar e o isoflurano estão fluindo adequadamente através do cone nasal. Utilizar os mesmos parâmetros anestésicos descritos anteriormente (passo 5.12). Lubrifique e insira uma sonda de temperatura retal para monitorar continuamente a temperatura corporal do animal durante a aquisição de imagens. Coloque um respirador em contato com o mouse. Use fita adesiva para fixar uma almofada de ECG nos membros esquerdos, dianteiros direitos e posteriores esquerdos. Use gel de ultrassom para melhorar o sinal entre a almofada de ECG e a pele. Verifique o ECG e o sinal respiratório no software do computador para garantir que os complexos QRS adequados sejam vistos no monitor. Para fazer isso, marque Logic Lead na guia Source Set Up e escolha o lead que oferece a curva de ECG mais clara.NOTA: Os fios lógicos correspondem às três almofadas de ECG que estão conectadas ao peito direito, esquerdo e perna. Cada derivação representa uma curva de ECG. Definir ganho para a altura adequada do sinal, geralmente 4 ou 8 é bom. Selecione dual gating. Na guia Configuração de vídeo, ajuste as configurações de exibição para uma exibição clara do sinal: marque as caixas ao lado de ECG e RESP e defina cada uma como 500. Na guia Configuração do gatilho, confirme se Canal A, Canal B e DualTrig estão marcados. Certifique-se de que os seguintes parâmetros também estejam definidos: Limite: quando o sinal cai abaixo desse valor; defina o valor como 2.500; Histerese: garantir que o sinal cruze a histerese para criar um ponto de gatilho de software no qual um novo ciclo de disparo se inicia; defina o valor como 300; Atraso: aguarde antes que o gatilho seja enviado; defina o valor como 100; Inibir: nenhum sinal pode ser gerado durante este período, defina o valor como 200. Certifique-se de que o limite para ECG esteja abaixo do valor de histerese e acima do pico do segmento sT na tela de exibição. Avançar o animal para dentro do scanner e pressione Atualizar imagem. Adquira uma imagem de raios-X do animal para selecionar o campo de visão apropriado e a cobertura anatômica da varredura para a imagem subsequente da microTC. Realizar a aquisição das imagens da angiotomografia utilizando os seguintes parâmetros: Ampliações: Ultra foco, Ângulo de varredura: Verificação completa (360), Energia: Única, Modo de varredura: Gated, Configuração: Padrão (rotação completa de 360°, configurações padrão do tubo de raios X de 0,33 mA e 55 kV, 0,750° grau por passo, 1 projeção por passo, 1 x 1 binning e tempo de exposição de 40 ms; dual gating significa sincronização cardíaca e respiratória) (Figura 11). Após a conclusão do exame, transfira o animal para uma gaiola de recuperação pré-aquecida. Uma vez que o animal tenha se recuperado totalmente, transfira-o de volta para sua gaiola primária. Reconstrua imagens de microTC usando o software do sistema. Depois de carregar a imagem, defina as barras azuis para que ela se estenda pela área anatômica de interesse; Visualize uma fatia para tornar o volume menor e o mais restrito possível ao mouse (esse estágio ajuda a reduzir o tamanho da imagem reconstruída). Ative o contorno do volume de interesse para otimizar o limite da imagem. Escolha o tamanho do voxel de 40 μm, o filtro de projeção Hann e o filtro de volume gaussiano (80 μm). Ir para Avançado | Ajuste as janelas de gatilho e a fase para 0,5 e 0,6, respectivamente, escolha 10 fases para sincronização cardíaca e, em seguida, pressione o botão de reconstrução de volume .

Representative Results

Para aqueles pesquisadores que não são cirurgiões, não estão familiarizados com a anatomia ou não se sentem confortáveis em interpretar os resultados radiológicos, a análise adequada das imagens deve ser feita por pessoal com treinamento adequado. O sucesso de um TQO em um camundongo é demonstrado no protocolo acima. Além disso, para melhorar as métricas do estudo e fornecer feedback em tempo real para o sucesso de um transplante, bem como eliminar a necessidade de necropsia, uma angiotomografia pode ser usada para fornecer imagens precisas e claras. Imagens representativas estão incluídas neste manuscrito (Figura 11). Imagens representativas de falha na anastomose in vivo podem ser vistas na Figura 12. Aqueles familiarizados com a anatomia hepática e vasculatura podem ver anastomoses venosas pérvias da VCI. Em algumas circunstâncias, a veia porta também pode ser visualizada, o que é feito facilmente neste modelo devido ao manguito da veia porta. A visualização das anastomoses abertas indica o sucesso técnico da operação. Além disso, a reconstrução 3D dessas imagens pode fornecer informações adicionais aos pesquisadores e uma imagem mais detalhada da anatomia vascular. Utilizando este modelo acima, a mortalidade na coorte de camundongos OLT é de ~40-45%. Figura 1: Visão geral do transplante ortotópico de fígado. (A) Desenho gráfico descrevendo as quatro diferentes anastomoses: i) anastomose supra-hepática da VCI, ii) anastomose da VCI infra-hepática, iii) anastomose da veia porta, iv) anastomose do ducto biliar comum. Cada seta indica um local relativo para onde o vaso ou ducto deve ser cortado – VCI supra-hepática (protocolo passo 2.13), VCI infra-hepática (protocolo passo 2.11), veia porta (protocolo passo 2.10) e ducto biliar comum (protocolo passo 2.7). (B) Diagrama in vivo das anastomoses. Barra de escala = 2 mm. Abreviação: VCI = veia cava inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Ferramentas cirúrgicas utilizadas na cirurgia. (A) pinça fina de 45°, (B-E) pinça fina, (F) porta-agulha curva/pinça, (G) pinça reta, (H) aplicador de pinça vascular, (I) hemostático, (J) porta-agulha, (K) eletrocautério, lâmina (L) #11, (M) afastador abdominal, (N,O) microtesoura, (P) tesoura fina, (Q) tesoura cirúrgica, (R,S) pinças de Yasargil, (T) pinça de veia bulldog, (U) pinça microvascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Manguito da veia porta e stent de via biliar. Imagem ex vivo dos stents e manguitos antes do uso. Barra de escala = 3,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Implante de stent no colédoco durante a operação do doador. (A) Colocação de stent biliar no colédoco ducto. (B) Stent de ducto biliar fixado dentro do ducto biliar. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Colocação do manguito da veia porta durante o preparo do aloenxerto hepático na mesa de fundo. (A) Rosqueamento da veia porta através do manguito venoso. (B) Veia evertida sobre o manguito. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Anastomose da veia porta durante a operação do receptor. (A) Inserção do manguito venoso na veia porta receptora. (B) Anastomose da veia porta fixada com sutura. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Anastomose da VCI supra-hepática durante a operação do receptor. (A) A parede posterior da anastomose está completa. (B) Anastomose SHIVC completada. Barra de escala = 2 mm. Abreviações: VCI = veia cava inferior; SHIVC = VCI supra-hepática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Anastomose infra-hepática da VCI durante a operação do receptor. (A) A parede posterior da anastomose está completa. (B) Anastomose completa do IHIVC. Barra de escala = 2 mm. Abreviações: VCI = veia cava inferior; IHIVC = VCI infra-hepática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9: Anastomose do ducto biliar comum durante a operação do receptor. (A) Colocação de stent de via biliar dentro do colédoco receptor. (B) Fixação da anastomose do ducto biliar. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 10: Preparação de animais com angiotomografia por microTC de camundongos. (A) Injeção da veia da cauda de camundongo para administração de contraste. (B) Camundongo sendo passado através de microtomógrafo. Abreviação: microCT = microtomografia computadorizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 11: Imagens representativas mostrando angiotomografia da patência do enxerto. (A,B) Contraste pode ser visto em toda a VCI, demonstrando perviedade das anastomoses supra-hepáticas e infra-hepáticas. (C) Contraste na veia porta, novamente demonstrando perviedade. (D) Reconstrução 3D da vasculatura. Abreviações: microCT = microtomografia computadorizada; VCI = veia cava inferior; VP = veia porta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 12: Imagens representativas mostrando falha nas anastomoses in vivo . (A) Falha na anastomose da veia porta por distorção da veia resultando em falta de fluxo sanguíneo. (B) Falha na anastomose da VCI supra-hepática devido a sangramento excessivo. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O TQO em roedores tem sido bem descrito na literatura 2,8. Para realizar este procedimento tecnicamente exigente, muitas vezes são necessários vários anos de microcirurgia (ou cirurgia em geral), pois isso envolve uma compreensão robusta da anatomia e habilidade técnica. No desenvolvimento deste modelo, nos deparamos com várias questões técnicas, todas girando em torno das anastomoses. Particularmente com a anastomose PV, muitas vezes é difícil estabilizar a veia para a anastomose. Descobrimos que a colocação de uma ou duas suturas (preferência do cirurgião) ajuda a facilitar a colocação do manguito. Deve-se notar que a colocação de mais suturas de permanência aumenta o tempo cirúrgico.

Além disso, o SHIVC é profundo dentro da cavidade abdominal e é difícil colocar uma pinça para dar exposição adequada. Descobrimos que, se o mouse estiver relaxado o máximo possível em sua contenção, isso aumentará a flexibilidade da veia. Em última análise, caberá ao cirurgião determinar o posicionamento adequado com a prática. Além disso, com a anastomose com CBD, o ducto fica novamente muito delicado. Pode ser difícil colocar suturas de permanência para estabilizar o ducto e, possivelmente, colocá-lo em um pequeno pedaço de gaze ajudará na sua estabilização. Finalmente, como todos os pequenos mamíferos são excepcionalmente delicados em relação ao tempo de anestesia, é importante realizar a cirurgia o mais rápido possível. Os tempos cirúrgicos ideais são: 1) operação do doador, 45-60 min; 2) preparação da mesa de fundo, 15 min; 3) operação do receptor, 60-80 min. A prática ajudará a diminuir o movimento desperdiçado.

À medida que os modelos animais avançam, a capacidade de avaliar o sucesso das intervenções estudadas também tem avançado. A microTC foi utilizada pela primeira vez para estudos de vasculatura em ratos no final da década de 199017. Existem muitos desafios para a realização de estudos precisos e claros de angiotomografia em roedores. No entanto, a maioria dos desafios decorre dos curtos ciclos cardíaco e respiratório desses mamíferos. Isso é superado com o uso de exposições curtas para limitar artefatos de movimento, bem como maiores taxas de fluência de fótons18. Em geral, observamos que o uso de sincronização cardíaca, bem como o ajuste das concentrações de isoflurano para diminuir a frequência respiratória, produziram as imagens mais claras. Observamos também que a utilização do tempo de contraste específico do roedor para fases específicas: fase arterial hepática, fase portal-venosa e fase tardia também melhorou a visualização19. O uso do contraste ExiTron nano 12000 tem várias vantagens e pode melhorar a qualidade geral da imagem. Oferece o realce de contraste mais forte no fígado20 e no sangue21. Outra vantagem é que o contraste está presente no fígado por até 120 h após a injeção inicial, o que poderia reduzir a toxicidade hepática associada, pois menos contraste é necessário se forem necessários exames repetidos20.

Além disso, como os exames são realizados com o camundongo sedado com isoflurano, o realce pelo meio de contraste não é alterado com essa alteração na fisiologia20. Empregando essas técnicas de imagem e contraste ExiTron, uma avaliação clara do sucesso das anastomoses em TOFO é possível. A microTC permite a avaliação não invasiva de aloenxertos in vivo por um período prolongado. Este protocolo diminui o número de animais que devem ser sacrificados para avaliação de anastomoses vasculares e proporciona a oportunidade de estudar a terapêutica ao longo de várias semanas e seu efeito na vasculatura.

Limitações
Deve-se notar que, embora várias revisões do modelo de TQO tenham ocorrido para aperfeiçoar sua técnica, a visualização das anastomoses utilizando microTC ainda é um processo em andamento. Além disso, o OLT de camundongo oferece uma visão única sobre a medicina de transplante. No entanto, não é um modelo abrangente, pois é difícil manter esses camundongos vivos após 1 semana. Modelos de transplante adicionais também devem ser usados para fundamentar ainda mais os experimentos pré-clínicos.

Conclusões
Os avanços na microTC progrediram rapidamente na última década, fornecendo aos pesquisadores novas ferramentas inestimáveis no campo de modelos animais e transplante. No futuro, imagens 3D mais detalhadas oferecerão mais informações sobre pesquisa e descoberta.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O SMB é apoiado pelo National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) R01DK1234750. A BAW é apoiada através da concessão do National Institutes of Health, National Heart Lung and Blood Institute R01HL143000.

Materials

#11 Blade Fisher Scientific 3120030
4-0 silk suture Surgical Specialties Corp. SP116
6-0 nylon suture AD Surgical S-N618R13
7-0 nylon suture AD Surgical S-N718SP13
8-0 nylon suture AD Surgical XXS-N807T6
10-0 nylon suture AD Surgical M-N510R19-B
20 G Angiocath Boundtree 602032D
30 G Needle Med Needles BD-305106
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets Elanco NA
Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer USA Medical and Surgical Supplies BM-DEL1
Bulldog Vein Clamp 1 1/8 Ambler Surgical USA 18-181
C57BL/6J mice  Jackson Labs
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Store RS-5668
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Science tools 11254-20
Dumont #5 Forceps Fine Science tools 11252-50
Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° Fine Science tools 11253-25
ExiTron nano 12000 Miltenyi Biotec 130 - 095 - 698 CT contrast agent 
Forceps Fine Science tools 11027-12
Halsted-Mosquito Hemostat Roboz Surgical RS-7112
heparin Fresnius Lab, Lake Zurich, IL C504701
histidine-trypotophan-ketoglutarate  University Pharmacy NA
Insulated Container YETI ROADIE 24 HARD COOLER https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
ketamine Hikma Pharmaceuticals PLC NDC 0413-9505-10
Mirco Serrefines Fine Science tools 18055-05
Mouse Rectal Temperature Probe WPI Inc NA
NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight Micrins MI1540
PE10 Tubing  Fisher Scientific BD 427400
perfadex XVIVO Perfusion AB REF99450
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT
Puralube Ophthalmic Ointment Dechra NA
saline PP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-186-10
Scissors Fine Science tools 14090-11
Small Mouse Restraint – 1” inner diameter Pro Lab Corp MH-100
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent scientific SS-MVG-Module
Surgical microscope Leica M500-N w/ OHS
U-CTHR MI Labs NA CT Scanner software
Vannas-Tubingen Spring Scissors Fine Science Tools 15008-08
xylazine Korn Pharmaceuticals Corp NDC 59399-110-20
Yasagil clamp Aesculap FT351T
Yasagil clamp Aesculap FT261T
Yasagil clamp applicator Aesculap FT484T

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Zeng, Q., Gouchoe, D. A., Nabavinia, M., Lee, Y. G., Wang, X., Shaffer, T. A., Stacy, M. R., Peterson, B. R., Whitson, B. A., Breuer, C., Black, S. M. Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography. J. Vis. Exp. (199), e65537, doi:10.3791/65537 (2023).

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