Transplante Ortotópico de Fígado em Camundongos Utilizando Angiotomografia Microcomputadorizada

Camundongos C57BL/6J machos (30 g de peso corporal) foram alojados em condições livres de patógenos no Nationwide Children’s Hospital Animal Facility. Todos os procedimentos foram realizados humanamente de acordo com o NIH e o National Research Council’s Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals e com a aprovação do Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol AR17-00045). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos e equipamentos usados neste protocolo. 1. Configuração inicial para a cirurgia de transplante Configurar dispositivos cirúrgicos.Configure dispositivos de monitoramento cirúrgico (ou seja, dispositivo de monitoramento de frequência cardíaca, pulso-ox, sistema de monitoramento modular) e aparelhos de anestesia. Se disponível, ligue a placa de aquecimento cirúrgica a 42 °C. Certifique-se de que os aparelhos de ventilação e anestesia estejam ligados para aquecer o evaporador de isoflurano. Encher o reservatório de anestesia com 30 mL de isoflurano líquido e garantir que a máquina do ventilador esteja conectada ao oxigênio.OBS: Neste protocolo, não intubamos o animal; Use apenas um cone nasal para oxigenação. Registre o peso corporal dos camundongos receptores e doadores. Ligue o microscópio cirúrgico de alta potência e ajuste a altura e o foco de acordo com as preferências do cirurgião. Certifique-se de que os dispositivos cirúrgicos restantes estejam ligados (ou seja, dispositivo de eletrocautério). Preparar e dispor instrumentais cirúrgicos, bem como laços cirúrgicos de náilon 10-0 (Figura 2).OBS: Todos os instrumentais cirúrgicos foram autoclavados a 121 °C por 30 min. Além disso, diferentes configurações de instrumentais cirúrgicos poderiam ser igualmente eficazes. Preparar os manguitos para os stents da veia porta (VP) e do ducto biliar comum (CBD) (Figura 3). Colocar o cateter angio, bem como o PE10, em uma superfície estéril sob o microscópio de alta potência. Usando uma lâmina cirúrgica #11, corte o cateter angiodinâmico para formar um manguito de 1,5 mm de comprimento com uma aba de aproximadamente 0,75 mm na parte superior do corpo do manguito; cortar a tubulação de polietileno (PE10) para 2,5 mm de comprimento. Armazenar os manguitos e o stent em soro fisiológico estéril até que estejam prontos para uso.NOTA: Este modelo de transplante utiliza um cateter angiocateter 20G para confecção de manguitos para reconstrução de PV, bem como um tubo de polietileno 10 (PE10) para a reconstrução do CBD. Todas as outras anastomoses são costuradas à mão. Preparar soluções. Preparar uma injeção de heparina que será administrada a 100 U em 0,5 mL de solução de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK). Armazenar soro fisiológico, heparina-salina, PBS, e solução de preservação HTK no gelo. 2. Aquisição de ratos doadores Induzir anestesia no camundongo doador colocando-o em uma câmara de inalação de isoflurano. Certifique-se de que a concentração de isoflurano é de aproximadamente 2,5% com um fluxo de oxigênio de 2 mL/min. Aguarde 5 min para que um plano cirúrgico de anestesia se desenvolva. Para garantir o nível adequado de anestesia, aperte o mouse para provocar uma reação; A falta de reação indica que o nível adequado de anestesia foi atingido. Faça a barba do abdômen do mouse usando cortadores eletrônicos e coloque o mouse na posição supina na placa de aquecimento. Limpe o abdômen com iodopovidona, depois etanol 70%. Coloque pomada oftálmica sob os olhos dos ratos para evitar o ressecamento. Colocar o camundongo sob o microscópio de alta potência e mantê-lo sob anestesia usando uma inalação de isoflurano de concentração de 2% com um fluxo de oxigênio de 2 mL/min. Realizar laparotomia mediana com tesoura (preferência do cirurgião) desde o processo xifoide até a sínfise púbica. Em seguida, realize uma incisão transversal adicional para criar um padrão “tipo cruz” inferior às costelas. Usando pinças hemostáticas de mosquito, retrair o processo xifoide para obter exposição adequada do conteúdo abdominal.NOTA: A pinça pode ser fixada dependendo da preferência do cirurgião. Eviscerar os intestinos e colocá-los no lado esquerdo da cavidade abdominal em uma esponja de gaze molhada. Mobilize o fígado retirando todos os anexos ligamentares. Expor a artéria hepática adequada (pHA). Esqueletizar o vaso utilizando pinça curva e ligá-lo com fio de náilon 10-0. Disseque todo o comprimento do CBD usando uma combinação de dissecção nítida e contundente. Realizar uma ductotomia (grande o suficiente para o stent CBD) o mais próximo possível da borda superior do pâncreas para dar um comprimento adequado para uso futuro (~1 cm da borda inferior do fígado). Insira o stent do ducto biliar no CBD com pinça fina e fixe-o com uma sutura de náilon 10-0. Ligate a face distal do CBD com fio de náilon 10-0 (Figura 4). Retrair o lobo hepático direito em direção ao xifoide usando uma esponja de gaze úmida e expor a VCI. Mobilizar a VCI infra-hepática (IHIVC) para longe do retroperitônio e cauterizar a veia adrenal direita usando um dispositivo de cautério portátil (ver Tabela de Materiais). Dissecar a artéria e veia renais direitas e ligar com náilon 7-0 e 10-0, respectivamente. Cortar a veia e artéria renais direitas e anexos ligamentares remanescentes. Finalmente, remova o rim direito.NOTA: Isso é feito para ter melhor exposição ao finalmente cortar o IHIVC. Injetar 0,5 mL de HTK frio com solução de heparina 100 U através do PV com uma agulha de 30 G. Aguarde 1 min para que a heparina se distribua sistematicamente. Corte a veia porta logo superior à veia esplênica e veia mesentérica superior. Injetar lentamente solução fria de preservação de HTK com heparina no IHIVC com uma agulha de 30 G para perfundir o fígado do doador. Pare de injetar a solução quando o fluido proveniente do PV estiver límpido. Após a injeção, coloque uma micropinça no IHIVC logo superior à veia renal direita e corte logo inferiormente à pinça. Concluída essa etapa, desligue o ventilador e pare com o isoflurano, pois o animal acabou de ser eutanasiado. Cortar o CBD distalmente ao stent que foi previamente colocado no passo 2.7. Além disso, identificar o ducto cístico e ligadura do ducto com fio de náilon 10-0. Em seguida, segure a cúpula da vesícula biliar com um par de pinças e disseque livre da fossa da vesícula biliar usando uma combinação de dissecção afiada e romba. Uma vez que a vesícula biliar esteja adequadamente mobilizada, usando uma tesoura de mola, complete a colecistectomia cortando o ducto cístico acima da sutura previamente colocada. Retrair o fígado inferiormente para expor a VCI supra-hepática (CVSI). Corte o SHIVC prestando especial atenção para dar um comprimento adequado para a anastomose no animal receptor. Disseque os anexos ligamentares adicionais livres para o fígado e entregar o fígado do doador ex-vivo e colocar o órgão em um recipiente com soro fisiológico frio. 3. Preparo da mesa traseira do aloenxerto hepático Coloque gelo em um recipiente isolado e coloque uma placa de Petri no leito de gelo. Encha a placa de Petri com soro fisiológico gelado. Coloque o aloenxerto de fígado na placa para que a superfície visceral fique exposta. Colocar o PV através do manguito previamente selecionado e everter a veia de modo que a superfície endotelial interna fique exposta. Fixar o manguito com fio de náilon 10-0. Certifique-se de que a sutura fique dentro dos sulcos do manguito para obter os melhores resultados (Figura 5). Ajustar o aloenxerto hepático para expor o SHIVC e colocar dois 8-0 suturas de náilon às 3′ e 9 horas, respectivamente, para eventual anastomose no animal receptor. Ajustar novamente o aloenxerto hepático para expor o IHIVC e colocar dois 8-0 suturas de náilon às 3′ e 9 horas, respectivamente, para eventual anastomose no animal receptor. 4. Operação do destinatário OBS: Como se trata de uma operação estéril, utilizar luvas e equipamentos de proteção individual adequados e administrar antibióticos. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea como analgesia pré-operatória no momento da cirurgia. Expor o pHA como na operação do doador; utilizar apenas uma laparotomia mediana em vez da incisão abdominal descrita anteriormente. Mobilizar o fígado e cortar todos os anexos ligamentares. Além disso, ligadura dos vasos frênicos e paraesofágicos esquerdos com fio de náilon 10-0. Retrair o fígado inferiormente e dissecar liberar a SHIVC do retroperitônio. Em seguida, retrair superiormente o fígado e dissecar o IHIVC do retroperitônio. Cauterizar pequenas veias em ponte e veias lombares, conforme necessário, usando a mesma técnica descrita anteriormente. Cauterizar a veia adrenal direita com cautério manual e expor o hilo hepático. Ligate o pHA com fio de náilon 10-0. Em seguida, dissecar o CBD livre do PV e ligar o CBD com sutura 7-0 próximo à bifurcação do CBD para dar um comprimento adequado para a anastomose do CBD. Utilizar uma micropinça para pinçar a VCI infra-hepática e ligar temporariamente o PV com uma sutura 7-0. Iniciar a fase an-hepática. Parar a inalação de isoflurano.NOTA: Após o pinçamento da veia porta e da VCI, o retorno venoso hepático é completamente bloqueado na fase anepática. O anestésico inalatório isoflurano é metabolizado pelo fígado; assim, sua inalação é momentaneamente interrompida, pois o acúmulo pode levar ao colapso cardiopulmonar. Através da PV do fígado nativo, injetar 0,5 mL de solução salina de heparina com uma agulha de 30 G para lavar o órgão. Colocar pinças microvasculares no SHIVC e IHIVC o mais proximal e distalmente possível para deixar um comprimento adequado para a anastomose. Cortar o SHIVC, IHIVC, PV nativo (próximo à sutura previamente colocada) e quaisquer anexos ligamentares remanescentes ao fígado nativo do receptor e entregar o fígado nativo ex vivo.NOTA: A pinça IHIVC deve estar acima da veia renal direita. Colocar o aloenxerto hepático do doador dentro da cavidade abdominal e retrair o hilo do aloenxerto do doador para expor as VVPP. Lave o PV doador e o PV nativo com 0,5 mL de solução salina de heparina usando uma agulha de 30 G para desarejar os vasos para evitar embolia gasosa. Em seguida, inserir o manguito previamente confeccionado do PV do doador na luz do PV hepático receptor e, se necessário, colocar suturas de permanência para auxiliar na anastomose (sutura 8-0). Fixar a anastomose com sutura 7-0 (Figura 6). Gire a placa em 180°. Realizar anastomose feita à mão com fio de náilon 10-0 com o doador e o SHIVC nativo. Após completar a anastomose de parede posterior, lavar com 0,5 mL de solução salina de heparina para desarejar para evitar embolia gasosa. Anastomose completa da parede superior (Figura 7). Remover primeiro a sutura de ligadura do PV; em seguida, remova as pinças vasculares do SHIVC para iniciar a reperfusão. Finalizar a fase an-hepática e reiniciar a inalação de isoflurano. Realizar anastomose de costura manual com fio de náilon 10-0, da mesma forma que para a anastomose SHIVC, para reconstrução do IHIVC. Após o término da reconstrução, retirar a micropinça do IHIVC nativo e doador para reperfusão (Figura 8). Realizar a anastomose do CBD criando uma ductotomia no CBD receptor próximo à sutura previamente colocada. Inserir o stent no CBD doador na luz do CBD do receptor e fixar a anastomose com sutura 10-0 (Figura 9). Irrigar a cavidade abdominal com 1 mL de soro fisiológico; verificar a hemostasia e cauterizar os vasos sangrantes remanescentes. Fechar a incisão abdominal em duas camadas utilizando sutura 6-0. Coloque o animal em uma incubadora aquecida (42 °C) para recuperação e não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência e atividade suficiente. Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea após a cirurgia e continuar a administração a cada 8 a 12 horas por 48 horas após a cirurgia. Além disso, administrar carprofeno (0,2 mL dissolvido em 400 mL de água) através da garrafa de água do animal receptor por até 7 dias após a cirurgia. Observe o animal receptor por 4-5 h e, uma vez que ele tenha se recuperado totalmente, devolva-o ao local de alojamento, pois agora é seguro estar com outros animais.NOTA: Medicamentos para dor e antibióticos podem ser administrados de acordo com as recomendações do comitê de ética animal local. 5. Imagem de angiotomografia em camundongos Depois de observar o camundongo para o intervalo de estudo pré-determinado, prepare o camundongo para avaliar a patência do aloenxerto usando angiotomografia. Certifique-se de que os aparelhos de ventilação e anestesia estejam ligados para aquecer o evaporador de isoflurano. Encher o reservatório de anestesia com 30 mL de isoflurano líquido e garantir que a máquina do ventilador esteja conectada ao oxigênio. Ligue o scanner de microtomografia computadorizada e verifique se todo o software está funcionando corretamente. Inicie o software de aquisição no sistema do scanner de microtomografia. No monitor da unidade de microCT, clique em Inicializar sistema e escolha Modo de tomografia computadorizada. Ejetar a cama; Conecte a cama do mouse e bloqueie-a. Ligue a placa de aquecimento a 42 °C para a gaiola de recuperação. Preencher uma seringa de 1 mL com 100 μL de contraste CT. Anexar uma agulha de calibre 30 para futura administração intravenosa de contraste. Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa. Coloque um rato no sistema de retenção da veia caudal. Quando o mouse estiver completamente dentro do sistema de retenção, feche o portão do sistema, deixe a cauda cair verticalmente e limpe-a cuidadosamente com uma solução de álcool (etanol 70%).NOTA: O sucesso na canulação da veia da cauda pode ser aumentado aquecendo a cauda do animal segurando-a em uma mão enluvada por vários minutos. Segure a cauda em direção ao aspecto distal e coloque dois dedos (indicador e médio) ao redor da cauda proximal ao local de injeção planejado. Coloque o aspecto distal da cauda (abaixo do local da injeção) entre o polegar e o dedo anelar. Com ambos os conjuntos de dedos, aplique uma leve pressão e insira a agulha na veia usando uma profundidade rasa, garantindo que a seringa e a agulha fiquem paralelas à cauda. Ao liberar a pressão do dedo indicador na cauda proximal, administre o contraste por via intravenosa. Evite a aspiração com a seringa, pois isso pode causar o colapso da veia.NOTA: Nenhuma resistência deve ser sentida durante a injeção se a agulha estiver adequadamente posicionada na veia. Se houver resistência, remova a agulha e volte a inseri-la acima do local de injeção original. Se a canulação da veia falhar mesmo após duas tentativas, substitua a agulha. Depois de injetar com sucesso o contraste e remover a agulha, aplique uma compressão suave no local da injeção usando gaze estéril para parar o sangramento. Transfira o camundongo para a câmara de inalação de isoflurano e ajuste a concentração para 2,5% com um fluxo de oxigênio de 2 mL/min e aguarde 3-4 min. Uma vez estabelecido um plano de anestesia, transferir rapidamente o mouse para o leito do microtomógrafo e colocá-lo em decúbito ventral na mesa do scanner (Figura 10). Cubra os olhos do animal com a quantidade adequada de pomada oftálmica. Coloque o cone nasal adequadamente sobre o animal e certifique-se de que o ar e o isoflurano estão fluindo adequadamente através do cone nasal. Utilizar os mesmos parâmetros anestésicos descritos anteriormente (passo 5.12). Lubrifique e insira uma sonda de temperatura retal para monitorar continuamente a temperatura corporal do animal durante a aquisição de imagens. Coloque um respirador em contato com o mouse. Use fita adesiva para fixar uma almofada de ECG nos membros esquerdos, dianteiros direitos e posteriores esquerdos. Use gel de ultrassom para melhorar o sinal entre a almofada de ECG e a pele. Verifique o ECG e o sinal respiratório no software do computador para garantir que os complexos QRS adequados sejam vistos no monitor. Para fazer isso, marque Logic Lead na guia Source Set Up e escolha o lead que oferece a curva de ECG mais clara.NOTA: Os fios lógicos correspondem às três almofadas de ECG que estão conectadas ao peito direito, esquerdo e perna. Cada derivação representa uma curva de ECG. Definir ganho para a altura adequada do sinal, geralmente 4 ou 8 é bom. Selecione dual gating. Na guia Configuração de vídeo, ajuste as configurações de exibição para uma exibição clara do sinal: marque as caixas ao lado de ECG e RESP e defina cada uma como 500. Na guia Configuração do gatilho, confirme se Canal A, Canal B e DualTrig estão marcados. Certifique-se de que os seguintes parâmetros também estejam definidos: Limite: quando o sinal cai abaixo desse valor; defina o valor como 2.500; Histerese: garantir que o sinal cruze a histerese para criar um ponto de gatilho de software no qual um novo ciclo de disparo se inicia; defina o valor como 300; Atraso: aguarde antes que o gatilho seja enviado; defina o valor como 100; Inibir: nenhum sinal pode ser gerado durante este período, defina o valor como 200. Certifique-se de que o limite para ECG esteja abaixo do valor de histerese e acima do pico do segmento sT na tela de exibição. Avançar o animal para dentro do scanner e pressione Atualizar imagem. Adquira uma imagem de raios-X do animal para selecionar o campo de visão apropriado e a cobertura anatômica da varredura para a imagem subsequente da microTC. Realizar a aquisição das imagens da angiotomografia utilizando os seguintes parâmetros: Ampliações: Ultra foco, Ângulo de varredura: Verificação completa (360), Energia: Única, Modo de varredura: Gated, Configuração: Padrão (rotação completa de 360°, configurações padrão do tubo de raios X de 0,33 mA e 55 kV, 0,750° grau por passo, 1 projeção por passo, 1 x 1 binning e tempo de exposição de 40 ms; dual gating significa sincronização cardíaca e respiratória) (Figura 11). Após a conclusão do exame, transfira o animal para uma gaiola de recuperação pré-aquecida. Uma vez que o animal tenha se recuperado totalmente, transfira-o de volta para sua gaiola primária. Reconstrua imagens de microTC usando o software do sistema. Depois de carregar a imagem, defina as barras azuis para que ela se estenda pela área anatômica de interesse; Visualize uma fatia para tornar o volume menor e o mais restrito possível ao mouse (esse estágio ajuda a reduzir o tamanho da imagem reconstruída). Ative o contorno do volume de interesse para otimizar o limite da imagem. Escolha o tamanho do voxel de 40 μm, o filtro de projeção Hann e o filtro de volume gaussiano (80 μm). Ir para Avançado | Ajuste as janelas de gatilho e a fase para 0,5 e 0,6, respectivamente, escolha 10 fases para sincronização cardíaca e, em seguida, pressione o botão de reconstrução de volume .