Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlardan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin Peptitlerinin Tanımlanması
Summary
Bu protokol, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile makrofajlardan küçük hücre dışı vezikülleri izole etmek ve kütle spektrometrisi ile tanımlamak için peptidomu çıkarmak için bir prosedürü açıklar.
Abstract
Küçük hücre dışı veziküller (sEV’ler) tipik olarak multiveziküler cisimlerin (MVB’ler) ekzositozu ile salgılanır. <200 nm çapındaki bu nanoveziküller, çeşitli vücut sıvılarında bulunur. Bu sEV'ler, proteinler, DNA, RNA ve metabolitler gibi kargoları aracılığıyla gen transkripsiyonu ve translasyonu, hücre çoğalması ve hayatta kalması, bağışıklık ve iltihaplanma gibi çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Şu anda, sEV'lerin izolasyonu için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bunlar arasında, ultrasantrifüj tabanlı yöntem altın standart olarak kabul edilir ve sEV'lerin izolasyonu için yaygın olarak kullanılır. Peptitler, doğal olarak 50 amino asitten daha az uzunluğa sahip biyomakromoleküllerdir. Bu peptitler, hormonlar, nörotransmiterler ve hücre büyüme faktörleri gibi biyolojik aktiviteye sahip çeşitli biyolojik süreçlere katılır. Peptidom, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile spesifik biyolojik numunelerdeki endojen peptitleri sistematik olarak analiz etmeyi amaçlamaktadır. Burada, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile sEV'leri izole etmek için bir protokol tanıttık ve LC-MS/MS ile tanımlanmak üzere peptidomu ekstrakte ettik. Bu yöntem, kemik iliği kaynaklı makrofajlardan yüzlerce sEV türevi peptit tanımladı.
Introduction
Çapı 200 nm’den küçük olan küçük hücre dışı veziküller (sEV’ler) hemen hemen her tür vücut sıvısında bulunur ve idrar, ter, gözyaşı, beyin omurilik sıvısı ve amniyotik sıvı dahil olmak üzere her türlü hücre tarafından salgılanır1. Başlangıçta, sEV’ler hücresel atıkların bertarafı için kaplar olarak kabul edildi ve bu da sonraki on yılda minimum araştırmaya yol açtı2. Son zamanlarda, artan kanıtlar sEV’lerin spesifik proteinler, lipitler, nükleik asitler ve diğer metabolitler içerdiğini göstermektedir. Bu moleküller hedef hücrelere3 taşınır ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur ve bu sayede doku onarımı, anjiyogenez, bağışıklık4 ve iltihaplanma 5,6, tümör gelişimi ve metastaz 7,8,9 vb. gibi çeşitli biyolojik süreçlere katılırlar.
sEV’lerin incelenmesini kolaylaştırmak için, sEV’leri karmaşık numunelerden izole etmek zorunludur. sEV’lerin yoğunlukları, partikül boyutları ve yüzey işaretleyici proteinleri gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerine dayalı olarak farklı sEV izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Bu teknikler arasında ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, partikül boyutuna dayalı yöntemler, immünoaffinite yakalama tabanlı yöntemler, sEV’lerin çökeltme tabanlı yöntemleri ve mikroakışkan tabanlı yöntemlerbulunur 10,11,12. Bu teknikler arasında, ultrasantrifüj tabanlı yöntem, sEV izolasyonu için altın standart olarak kabul edilmektedir ve en yaygın kullanılan tekniktir13.
Artan miktarda kanıt, çeşitli organizmaların peptidomlarında keşfedilmemiş çok sayıda biyolojik olarak aktif peptitin varlığını göstermektedir. Bu peptitler, büyüme, gelişme, stres tepkisi14,15 ve sinyal iletimini16 düzenleyerek çok sayıda fizyolojik sürece önemli ölçüde katkıda bulunur. sEV’lerin peptidomunun amacı, bu sEV’ler tarafından taşınan peptitleri ortaya çıkarmak ve biyolojik işlevlerine dair ipuçları sağlamaktır. Burada, diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla sEV’leri izole etme protokolünü ve ardından peptidomlarının daha fazla analizi için bu sEV’lerden peptitlerin ekstraksiyonunu sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
sEV’lerin işlevini araştırırken, olası kontaminasyonları önlemek için karmaşık biyolojik numunelerden yüksek saflıkta sEV’ler elde etmek zorunludur. sEV’lerin izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir13 ve bu yöntemler arasında, diferansiyel ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, sEV’lerin nispeten yüksek saflığını göstermiştir. Bu çalışmada, 6 saat boyunca 200 mL hücre süpernatantı toplandı ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile yaklaşık 200-300 μg sEV…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (3157270) alınan hibelerle desteklenmiştir. Dr. Feng Shao’ya (Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Çin) iBMDM’yi sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
