تحديد الببتيدات للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الضامة المشتقة من نخاع العظام
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن الضامة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي واستخراج الببتيدوم لتحديده بواسطة مطياف الكتلة.
Abstract
عادة ما يتم إفراز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) عن طريق الإخراج الخلوي للأجسام متعددة الحويصلات (MVBs). هذه الحويصلات النانوية التي يبلغ قطرها <200 نانومتر موجودة في سوائل الجسم المختلفة. تنظم هذه الخلايا الجذعية عمليات بيولوجية مختلفة مثل نسخ الجينات وترجمتها ، وتكاثر الخلايا وبقائها ، والمناعة والالتهابات من خلال شحناتها ، مثل البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي والمستقلبات. حاليا ، تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل sEVs. من بينها ، تعتبر الطريقة القائمة على الطرد المركزي الفائق المعيار الذهبي وتستخدم على نطاق واسع لعزل sEVs. الببتيدات هي جزيئات حيوية بشكل طبيعي مع أقل من 50 من الأحماض الأمينية في الطول. تشارك هذه الببتيدات في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ذات النشاط البيولوجي ، مثل الهرمونات والناقلات العصبية وعوامل نمو الخلايا. يهدف الببتيدوم إلى التحليل المنهجي للببتيدات الداخلية في عينات بيولوجية محددة بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS). هنا ، قدمنا بروتوكولا لعزل sEVs عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي واستخلصنا الببتيدوم لتحديد الهوية بواسطة LC-MS / MS. حددت هذه الطريقة المئات من الببتيدات المشتقة من sEVs من الضامة المشتقة من نخاع العظام.
Introduction
توجد حويصلات صغيرة خارج الخلية (sEVs) بقطر أقل من 200 نانومتر في جميع أنواع سوائل الجسم تقريبا وتفرزها جميع أنواع الخلايا ، بما في ذلك البول والعرق والدموع والسائل النخاعيوالسائل الأمنيوسي 1. في البداية ، تم اعتبار sEVs كأوعية للتخلص من النفايات الخلوية ، مما أدى إلى الحد الأدنى من البحث في العقداللاحق 2. في الآونة الأخيرة ، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن sEVs تحتوي على بروتينات محددة ، ودهون ، وأحماض نووية ، ومستقلبات أخرى. يتم نقل هذه الجزيئات إلى الخلايا المستهدفة3 ، مما يساهم في التواصل بين الخلايا ، والتي من خلالها يشاركون في العمليات البيولوجية المختلفة ، مثل إصلاح الأنسجة ، وتكوين الأوعية الدموية ، والمناعة4 والالتهاب 5,6 ، وتطور الورم وورم خبيث7،8،9 ، إلخ.
لتسهيل دراسة المركبات الكهربائية ، من الضروري عزل المركبات الكهربائية من العينات المعقدة. تم تطوير طرق عزل مختلفة للمركبات الكهربائية بناء على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمركبات الكهربائية ، مثل كثافتها وحجم الجسيمات وبروتينات علامات السطح. تشمل هذه التقنيات الطرق القائمة على الطرد المركزي الفائق ، والطرق القائمة على حجم الجسيمات ، والطرق القائمة على التقاط التقارب المناعي ، والطرق القائمة على هطول الأمطار sEVs ، والطرق القائمة على الموائع الدقيقة10،11،12. من بين هذه التقنيات ، يتم التعرف على الطريقة القائمة على الطرد المركزي الفائق على نطاق واسع باعتبارها المعيار الذهبي لعزل المركبات الكهربائية وهي التقنية الأكثر استخداما13.
تشير كمية متزايدة من الأدلة إلى وجود العديد من الببتيدات النشطة بيولوجيا غير المكتشفة في الببتيدات لمختلف الكائنات الحية. تساهم هذه الببتيدات بشكل كبير في العديد من العمليات الفسيولوجية من خلال تنظيم النمو والتطور والاستجابة للإجهاد14،15 ونقل الإشارة16. الهدف من الببتيدوم الخاص ب sEVs هو الكشف عن الببتيدات التي تحملها هذه المركبات الكهربائية وتقديم أدلة على وظائفها البيولوجية. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل sEVs من خلال الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، يليه استخراج الببتيدات من هذه sEVs لمزيد من التحليل للببتيدوم الخاص بهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند التحقيق في وظيفة sEVs ، من الضروري الحصول على sEVs عالية النقاء من العينات البيولوجية المعقدة لتجنب أي تلوث محتمل. تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لعزل sEVs13 ، ومن بين هذه الطرق ، أظهرت الطرق التفاضلية القائمة على الطرد المركزي الفائق نقاء عاليا نسبيا للمركبات الكهربائية الكهر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (3157270). نشكر الدكتور فنغ شاو (المعهد الوطني للعلوم البيولوجية ، الصين) على توفير iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
